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标题:[分享帖]细胞爬片的保存和抗原修复问题总结

一叶[使用道具]
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发表于 2012-4-26 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
整理过程中一些细胞爬片的小细节技巧

（1）爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。这一步至关重要，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。
（2）PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏
（3）4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4°C的好，有人认为37°C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4°C冰箱中。我发现直接用4°C的溶液会造成细胞冷休克，从片上脱落。
（4）染色滴加抗体时，为了节省抗体，可以先把抗体滴加在干净的载波片上，然后玻片的细胞面朝向抗体倒扣，同时注意防止气泡 和玻片的正反。一般24毫米的玻片只需要30-50微升抗体。当然如果操作不熟练，抗体又足够，那就直接在玻片的细胞面上加抗体吧 。
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发表于 2012-4-26 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
爬片的前期处理
（1）取干净的盖玻片（剪去一角，以作为正反的标记）若干，用洗衣粉轻轻擦洗后烤干（注意轻柔，不要留下明显痕迹，方便以后观察细胞）。
（2）硫酸重铬酸钾过夜。
（3）取出盖玻片后，用自来水反复冲洗20遍。
（4）用一蒸水漂洗10分钟，三蒸水冲洗3遍。
（5）晾干后泡纯酒精过夜（主要是脱脂，也可用95%酒精），用镊子夹出（不能用手去接触玻片，否则应重新泡酒精脱脂），蒸馏水清洗后自然晾干（烤干容易使玻片留下水迹，而晾干的则清新干净）。
（6）高温高压消毒。
（7）再根据实验要求考虑是否包被多聚赖氨酸。
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一叶[使用道具]
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 小中大
个人的最后总结：

细胞爬片做组化不需要抗原修复，但是需要用tritonx－100通透，如果不放心的话，先不用修复，出不来结果的时候再试一试修复！
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发表于 2012-4-26 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
借形态宝帖求助高手！
我最近爬了不少片子，固定前镜下看细胞情况不错，细胞形态比较完整，铺展的也较开，结果当我每次用PBS洗2遍，75%酒精固定5-10分钟，然后再用PBS洗2遍后晾干并存放于4度冰箱，一周左右进行免疫细胞化学实验。
每张玻片出来的结果：镜下细胞的形态残破不堪，胞膜破碎不完整，甚至部分变形的比较厉害，直接导致组化结果不可信。一直不知何故，请几位形态版版主和各位高手帮忙分析一下，非常感谢！

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酒精固定的细胞我只做过一次，还是直接固定完就接着做IHC，没出现什么问题。
我觉得你这种情况会不会是PBS漂洗时震动太大破坏了细胞的贴壁效果？我每次PBS洗的时候都是把爬片放在PBS里浸泡，不晃动培养皿，每到最后一次漂洗完的时候都在镜下看看细胞形态。还没有出现过你的那种问题。
还有一点就是细胞固定前第一次洗的时候我用的都是4度的PBS，曾经用过一次常温的细胞形态就不太好，不知道这个有没有关系？
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发表于 2012-4-26 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
酒精固定的细胞我只做过一次，还是直接固定完就接着做IHC，没出现什么问题。
我觉得你这种情况会不会是PBS漂洗时震动太大破坏了细胞的贴壁效果？我每次PBS洗的时候都是把爬片放在PBS里浸泡，不晃动培养皿，每到最后一次漂洗完的时候都在镜下看看细胞形态。还没有出现过你的那种问题。
还有一点就是细胞固定前第一次洗的时候我用的都是4度的PBS，曾经用过一次常温的细胞形态就不太好，不知道这个有没有关系？

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楼上说得有道理，准备下次爬片留意下。
我用的PBS都是常温放置的，而且PBS漂洗时会来回晃几下，再加之我的细胞状态不太好，所以在免疫组化国程，可怜的细胞便越来越少，剩下几个也成变形金刚了！哎~不知和酒精固定有没有关系呢？据说酒精固定对细胞损伤大？那位高手问答下，谢谢啦！
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发表于 2012-4-26 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有哪位高手帮下忙。做细胞爬片染色时，所选用盖玻片有特殊要求吗？如无自发荧光盖玻片，因为我想做三维成像，有时片子背景比较深，很难做。有人用过吗？帮忙介绍一下！在哪儿可以买到无自发荧光盖玻片！有哪些公司有卖啊？多谢！
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发表于 2012-4-26 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞爬片：直接把培养板取出，吸出培养基，然后是用预热的PBS洗三次（5min*3）还是冷的PBS洗三次？用酒精、丙酮、多聚甲醛固定各有什么优缺点，哪种固定比较好？
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发表于 2012-4-26 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

据我的感觉（免疫荧光），有机溶剂如乙醇、丙酮做出来会干净点，但会使细胞收缩，抗原向核周集中，形态不太好。多聚甲醛细胞形态保持不错但非特异性高点，可能跟前者是脱水剂后者是交联剂有关
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发表于 2012-4-26 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PBS还是用温的好，冰PBS很容易脱避
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发表于 2012-4-26 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助：
我最近在作DC悬浮细胞的爬片，借贵宝地询问一下。
我的步骤是 ①将悬浮细胞离心，而后将细胞配成一定浓度5×10（5）
②将细胞液滴在多聚赖氨酸处理过的载玻片上，自然风干
③4％多聚甲醛固定20min ，晾干
④缓冲甘油封片
做完之后的镜下观察细胞的数目非常少，一个视野只有10来个细胞，完全达不到5×10 5次方浓度
请问有什么办法解决么？
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