小中大 脱落酸是诱导胚形成的一个重要的生长调节剂。
(5) 有机添加剂:培养的正常细胞能够合成其所需要的所有氨基酸,但是,当其中含有氨基酸(如谷氨酸)形式的有机氮和核苷酸存在时是有益的。外加氨基酸要慎重,因为这些氨基酸可能成为抑制剂。
(6) 胶凝剂:琼脂是一种最常用的凝固剂,它在组织培养中作为支撑物。琼脂的浓度过低,与水的亲和力不强,难以形成有效的支撑;琼脂的浓度过高,培养基就会变硬,妨碍营养向组织中扩散,离体生长将受到负面影响。
有支撑物的液体培养基可以取代固体培养基:
A 不含琼脂的液体培养基,以干净的泡沫塑料、玻璃纤维为支撑物
B 悬挂在液体培养基中的过滤纸桥
C 生长在有玻璃珠的液体培养基中
D 位于滤纸下的纤维胶海绵代替琼脂作为液体培养基的载体
(7) pH:pH决定着生物大分子的结构和活性的许多方面。对于外植体的离体培养,合适的营养培养基的pH值为5.0~6.0。一般情况下,pH﹥7.0或 pH﹤4.5时,生长和发育停止。培养基的pH在消毒前和消毒后不相同,一般情况下,经过高压消毒后的培养基,其pH值回降低0.3~0.5。 pH﹥6.0时,可以得到硬度合适的培养基,而pH﹤5.0时,琼脂就不能形成令人满意的凝胶。
主要试剂
详见实验步骤。
主要设备
镊子、解剖刀、培养皿、 苗瓶、 酒精瓶、 超净工作台、三角瓶、电炉等;
实验材料
种苗( 从分生部上沿切取一段约1cm左右的种苗茎,切好的外植体上应保留一片苗叶,若叶片上有萎黄部位,切除之),详见实验步骤。
实验步骤
1. 向烧杯中顺序加入培养基母液:
大量元素 25ml 微量元素 2.5ml 铁盐 2.5ml 维生素、肌醇和甘氨酸各2.5ml BA和NAA各2.0ml
2. 加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水,加入10g蔗糖和3.5g琼脂,将烧杯置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水准确稀释至500ml,继续加热几分钟使之混合后分装于10个100ml三角瓶中,以封口膜封口,用记号笔写上学号和姓名。
分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌,灭菌条件为温度121℃,压力1.1kg/cm2,灭菌时间20min左右,灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。
3. 将超净工作台用75%的酒精擦拭一遍,实验中需要用到的器具(镊子、解剖刀、培养皿)和装培养基的三角瓶也用75%的酒精擦拭一遍后置于超净工作台中。打开紫外灯和风机,处理20-30分钟。
4. 双手用肥皂洗净,再用75%酒精擦拭一遍后,连同用75%酒精擦拭过的种苗瓶一起进入超净工作台。进入超净工作台后,不得随意出入,以免染菌。实验过程中应尽量避免手直接接触。
5. 点燃酒精灯,将镊子和解剖刀在灯焰上烘烤后,插在酒精瓶中;在灯焰附近打开种苗瓶封口,从酒精瓶中取出镊子和解剖刀,灯焰上烘烤后切取种苗于培养皿,使用过的镊子和解剖刀放回酒精瓶(实验中使用镊子和解剖刀前均需在灯焰上烘烤灭菌,使用完后放回酒精瓶;在接种时,镊子应尽量多烘烤一段,以防镊子插入过深时,致使培养物染菌);瓶口和封口膜内侧灯焰上烘烤后封口;实验过程中应尽量避免手直接接触外植体材料。
6. 从分生部上沿切取一段约1cm左右的种苗茎,切好的外植体上应保留一片苗叶,若叶片上有萎黄部位,切除之。
7. 在灯焰附近打开培养基瓶封口,接种过程中,培养基瓶口应一直对准灯焰,手不得接触封口膜内侧;将切好的外植体材料垂直插入培养基中,一瓶接种1-2个。此过程应尽快完成后封口。
8. 接种好的三角瓶24℃培养。2天后观察,若有染菌需重做。一周后愈伤组织可形成。继续分两组培养:一组24℃光照培养,另一组24℃黑暗环境下培养,观察两组培养物再分化情况。