小中大 因此,Js4.2转子4000RCF离心8.9分钟的离心效果与JS5.2(rMAX=226mm)来重复上述条件则可算出所需的运行转速(n)。
n=1000√3430/1.12×226=3681r/min
也就是说JS5.2的离心速度为3681rpm时,产生的RCF是3430g。
二、离心技术常用的数学计算
W/w%、w/v%的换算及蔗糖母液的稀释:
用重量/重量百分数(w/w%)表示的浓度,在数值上与用重量/体积百分数(w/v%)表示的浓度相差极大,例如65%(w/w%)的蔗糖溶液在0℃时相当于86%(w/v%)。而对氯化铯(CsCl),这二者的差别就更大,如53%(w/w%)的CsCl相当于87%(w/v%)。
例:设有密度为1.638g/ml重量百分比浓度为32%(w/w)的氯化铯求其重量/体积百分数(w/v%)
由公式Cw/v=Cw/wXρ可知
Cw/v=32/100×1.638=53%
为方便一般可先配制较浓的母液如66%(w/w)的蔗糖溶液66%(w/w)
蔗糖溶液=2.55M=53%(w/v)折光指数=1.4558密度=1.3224g/ml在稀释时根据下面公式换算
V稀释后的体积×C稀释后浓度
V母液=C母液后浓度(w/v)
例:现有66%(w/v)的蔗糖溶液(p=1.3224),当配100m120% (w/w) (p=1.081)的蔗糖溶液时需要母液量如下:
V母液=100×1.081×20%/1.3224×66%=24.8ml
因此,取母液24.8ml,加水至100ml即成20%(w/w)的蔗糖溶液。
B.总离心效果ω2T及ω2T积分值的应用
离心过程中往往包括启动、加速、恒速、减速及运转终止等阶级,在离心机转子从静止开始被加速过程中,加在样品上的相对离心力也逐渐增大,在减速时,情况恰恰相反,一些较大的转子,其加、减速过程延误时间较长,对于较粗略的实验,往往简单地以恒速阶段的离心效果ω2T来表示,如进行较精密的分析实验,应将这段时间内样品粒子的移动纳入考虑的范围,除了恒速阶段的离心效果外,还要加上加、减速过程的离心效果,因此引入了总离心效果 --TCE(total centrifugal effect)并用∫ω2d t来表示,即ω2T的积分值。
∫ω2d t总离心效果用于计算粒子的沉降子数(S)。
S=1nr2 /rl /∫ω2d t=1nr2 /r 1/ TCE
r1:离心前粒子与轴心距离
r2:离心后粒子与轴心距离
目前Backman公司等一些生产厂家配有自动的ω2T积分器,当设置转速和运转时间后。全自动算出ω2T的积分值或设置ω2T值只需设一恒定的速度,离心机会自动确定所需的离心时间。
在设有ω2T自动积分器的情况下,可以利用ω2T图来计算总的离心效果,并可得到满意的结果,Backman公司给出了SW50.1等十种转子的ω2T图。这些图中虽只标出了二种密度曲线,对于其它密度可根据该二种密度曲线来估计所需的时间,也可以计算粒子的沉降系数。
例:计算离心时间
根据所希望的粒子的沉降位置从图中找出相应的Sω2T值
已知条件:实验用转子:SW50.1离心用介质:5-20%蔗糖密度:1.8g/ml,温度:20℃,转速:40000rpm,粒子沉降系数:30S=3x10Q。求:粒子在90mm处形成离心带需离心时间。
解:从SW50.1转子的Sω2T曲线图上可以查得总离心效果Sω2T=0.54
据ω2T=Sω2T/S=0.54/30=1.8
根据角速度ω和转速度RPM之间的换算公式ω=0.10472RPM
因此:ω2=(0.10472RPM)2=1.75×10所以:T=ω2T/ω2=1.8×10/1.75×10=10286秒
C.氯化铯(CsCl)沉降平衡曲线的应用
在实际工作中,往往从文献中查得分离某一物质的运行参数(温度、速度、起始密度等),但是,如果查不到这些参数,那么,究竟在什么条件下进行等密度离心,才能使离心结果满意呢?
在等密度离心中,常用氯化铯作梯度物质,所以Backman公司的每个转子说明书中都附有该转子的CsCl沉降及平衡曲线,利用这些曲线,就可得到最合适的运行参数。
三、离心分离的几种方法
制备型超高速离心机的几种分离方法:
A.差速离心:逐次增加离心力,每次可沉降样品溶液中的一些组份。
差速离心是一种最常用的方法。在这种方法中,离心管在开始时装满了均一的样品溶液。通过在一定速度下一定时间的离心后,就可得到两个部分:沉淀和上清液。
通常在第一次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时所需的组份大部分仍留在上清液中。然后将收集到得上清液可以进行一步的离心,把所需的粒子沉积下来。离心的时间要选择得当,使大部分不需要的更小的粒子仍留在上清液中。对于得到的沉淀和上清液可以进行一步的离心,直到达到所需要的分离纯度为止。
1、差速离心的特点是操作简单,但分离纯度不高。
B.密度梯度离心法:可以同时使样品中几个或全部组份分离,具有很好的分辨率。
1)速率区带法(rate zonal):
根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步骤如下:
在离心管中装入密度梯度溶液,溶液的密度从离心管顶部至底部逐渐增加(正梯度)。
将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成一负梯度。
由于不同大小的粒子在离心力作用下,在梯度中移动的速度不一样,所以经过离心后会形成几条分开的样品区带。
注意:样品粒子的密度必须大于梯度液注中任一点的密度。离心过程必须在区带到达管子底部前停止。
2)等密度离心法(isopycnic):
根据粒子的不同密度来分离。离心过程中,粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。密度样度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以在密度液粒上面或均匀分布在密度必须梯度中。经离心后,样品粒子达到它们的平衡点。注意:平衡后粒子的分离完全由其密度决定,与时间无关,此时再改变离心转速,只能改变区带的相对位置。
2、密度梯度分析法
1)、梯度介质性质与选择:
A.应具备的性质:
梯度物质的选择原则是满足分离方法的基本要求,一个理想的密度材料标准它应是:
l 所形成的溶液密度应包括所需要的密度范围。
l 具有某些性质,如折射率,据此可测定它的浓度。
l 所形成的溶液粘度低。
l 不损伤所分离的样品。
l 离心分离后容易除去。
l 不妨碍离积分的分析。
B.常用介质种类:
表一、常用梯度材料在20℃密度
C.梯度介质应用范围:
表二、等密度梯度介质的应用
+++很好 ++好 +可以 --不适用
表三、各种大分子在蔗糖梯度液中的大约密度
2)、梯度溶液的准备:
计算
稀释(本文第三章第一部分)
3)、梯度形状
梯度形状分:线型、等速型、阶梯型、平坦型、陡峭型指数梯度。(如下图)
梯度形状对于分离是否成功非常重要:
最常用的是线型梯度,适用于分离蛋白质、酶、激素、核糖体亚基和一些植物病毒;等速型适用于分离脂蛋白和一些需上浮分离样品;不连续或阶梯型梯度最适用于分离整细胞、亚细胞组分以及纯化一些哺乳类动物病毒或昆虫病毒。等速梯度以及长液柱可增进分离能力,适D.梯度柱制备:
梯度液柱可以用手工或梯度仪制备。
半注法:
为缩减离心时间,或分离样品较少可用半注法:下半管铺置梯度介质,中间加样品,上面铺Buffer或液体石蜡油。
4)、加样方法与加样量:
将样品加到梯度液柱上,针尖和离心管成45-60°角度,慢慢地将样品沿管壁流到液面上去,对于DNA一类易断的脆弱样品,应该用孔径较大的移液管代替针头,以避免剪切力对样品的切割作用。样品浓度是梯度柱最小密度的1/10(W/W)。
5)、转子的选择与效应:
6)、分离区带的回收及检测
离心后所形成的区带样品的回收方法基本有四种:
a.穿刺法:
穿刺离心管底部,使梯度溶液滴出,将一具有适合阀门的盖帽放在离心管顶,可控制滴出速度。
b.虹吸法:
将一毛细管轻轻插入管底,尽量防止梯度抖动,用微量泵逐渐滴取,以一定量滴数或体积部分收取。
c.加压法:
通过一针管将高密度的液体泵入到梯度离心管的底部,部分收集换出的溶液。
d.切割法
采用专用的切割刀切割所需区带。
区带检测:
所谓区带检测,实际上是对水平转子或角转子和垂直转子离心管中的分离物质所做的监测,通常只是测量在260或280mm时长的吸收值,以决定梯度中的核酸或蛋白的整个分布,这个操作通常称之为在线(on line)监测。