小中大通常可根据药物溶剂的残留情况选择合适的检查方法。当需要检查的有机溶剂数量不多,且极性差异较小时,可选择毛细管色谱柱-顶空进样-等温法。当需要检查的有机溶剂数量较多,且极性、沸点差异较大时,可选择毛细管色谱柱-顶空进样-程序升温法;也可选择填充柱或适宜极性的毛细管柱直接进样法。
限度检查(一类、部分二类溶剂)时采用内标法或外标法;定量测定(含量超过0.1%的二类或需要定量控制的三类溶剂)时采用内标法或标准加入法。
顶空进样法还要对顶空温度和顶空时间进行选择。
顶空温度应根据溶解供试品溶剂的特性及供试品中残留溶剂的沸点选择。以水为溶剂及测定低沸点残留溶剂时,顶空温度不宜超过85℃;测定沸点较高的残留溶剂时,通常选择较高的顶空温度;但此时应兼顾供试品的热分解特性,尽量避免供试品产生的挥发性热分解产物干扰测定结果。以DMSO为溶剂时,顶空温度不宜超过115℃。例如,在申报资料中发现,以水为溶剂,顶空温度为100℃,柱温60℃,结果高浓度的乙腈比低浓度的二氯甲烷的峰面积还小,原因是顶空温度太高,大量的水被蒸发(或浓度被稀释),随着水蒸汽的凝结,在水中溶解度大的乙腈的灵敏度下降,产生了与事实不符的实验结果。
顶空时间是要确保供试品溶液的气-液两相达到平衡,一般通过测定顶空时间与顶空气体浓度的浓度—时间曲线来确定。顶空时间不宜过长,一般为30~45分钟,如果超过60min,可能引起顶空瓶的气密性变差,导致定量的准确性降低。如果平衡时间选择10分钟,就不能保证气-液两相达到平衡。
注意对照品溶液与供试品溶液必须使用相同的顶空条件。
甲酰胺、2-甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、乙二醇、N-甲基吡咯烷酮等不适宜用顶空法测定。
三、残留溶剂检查方法的验证
1、系统适用性试验
柱效:用被测物的色谱峰计算,填充柱法的理论板数应大于1000,毛细管色谱柱的理论板数应大于5000。
分离度:色谱图中被测物色谱峰与其相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
重复性:以内标法测定时,对照品溶液连续进样5次,所得被测物与内标物峰面积之比的相对标准偏差(RSD)应不大于5%;以外标法测定时,所得被测物峰面积的相对标准偏差(RSD)应不大于10%。
2、准确度
在规定的范围内,至少9个测定结果。设计三个不同的浓度进行测定,计算回收率和相对标准偏差,含量测定的回收率应大于98%。
进行回收率试验时,由于采用顶空进样系统,供试品与对照品处于不完全相同的基质中,此时应考虑气-液平衡过程中的基质效应。标准加入法可以消除供试品溶液基质与对照品溶液基质不同所致的基质效应的影响,故通常采用标准加入法验证定量方法的准确性。当标准加入法与其它定量方法的结果不一致时,应以标准加入法的结果为准。
标准加入法为精密称(量)取被测定的残留溶剂对照品适量,配制成适当浓度的对照品溶液,取一定量精密加入到供试品溶液中,根据外标法或内标法测定残留留剂的含量,再扣除加入的对照品溶液的含量,即得供试液溶液中残留溶剂的含量;或按下式计算残留溶剂的量。Cx=ΔCx/[(Ais/Ax)-1],式中Cx为供试品中组分X的浓度;Ax为供试品中组分X的色谱峰面积;ΔCx为所加入的已知浓度的被测组分对照品;Ais为加入对照品后组分X的色谱峰面积。
3、专属性
对各种残留溶剂定位和进行混合溶剂的分离度试验,并附代表性图谱。
供试品中的未知杂质或其挥发性热降解产物易对残留溶剂的测定产生干扰。如果未知杂质或其挥发性热降解产物与被测物的保留值相同(共出峰),或热降解产物与被测物的结构相同(如甲氧基热裂解产生甲醇)时,应通过试验排除干扰。对第一类干扰,通常采用在另一种极性相反的色谱柱系统中对相同样品进行测定,比较不同色谱系统的测定结果的方法。如二者结果一致,则可以排除测定中有共出峰的干扰;如二者结果不一致,则表明测定中有共出峰的干扰。对第二类干扰,通常要通过测定已知不含该溶剂的对照样品来加以判断。
4、其它
可根据是限度检查还是定量测定选择具体的验证内容。
精密度:重复性和重现性,在规定范围内,至少9个测定结果。设计三个不同的浓度进行测定。一般保留时间的RSD<1%,峰面积的RSD<5%。
线性:至少制备5个浓度,R=0.99。附回归方程、相关系数和线性图。
检测限和定量限:检测限为信噪比3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量。定量测定时需验证定量限,其限度为信噪比10:1时相应浓度或注入仪器的量。同时说明测试的过程和结果,并附图谱。
以上是对残留溶剂检查方法研究的一些看法和建议,供大家参考。