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标题:[求助]转染带有GFP的目的基因载体后，观察不到荧光

bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-5-18 12:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]转染带有GFP的目的基因载体后，观察不到荧光




转染带有目的基因的EGFP-N1载体后，观察不到荧光,转染应该没问题。质粒浓度纯度都符合要求，且测序正确，无移码突变。不知道问题出现在什么地方，我于转染24，48小时后观察，都没有荧光，请大家帮帮我.
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2012-5-18 12:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以延长一下时间再观察荧光，有时间荧光的表达会延迟到3到5天的。
还有就是你是怎样确定转染没问题的，你的判断标准？
你最好做另外一个质粒试试你的转染是不是没有问题。
如果转染体系没有问题还是这样的话，那你的质粒的设计是不是合理？
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发表于 2012-5-18 12:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，不知楼主你转染的是什么细胞，但就我的经验，GFP表达最早的可在第二天能观察到，但到不了高峰，有的则是在5～6天后才会出现。不要着急，再等一下吧。
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发表于 2012-5-18 12:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你转染成功了吗？
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greenbee[使用道具]
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发表于 2012-5-18 12:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你转染的是什么细胞啊？用得是什么载体啊？我转染肿瘤细胞时使用纳米载体在第一天都有荧光，脂质体就更明显了。
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ending[使用道具]
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发表于 2012-5-18 12:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是EGFP-N1, 转染应该没有问题，因为转的空载体有荧光。谢谢的大家的帮助，我在多观察几天，真不行就在换一种载体。
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remenb[使用道具]
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发表于 2012-5-18 12:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是EGFP-N1, 转染应该没有问题，因为转的空载体有荧光。谢谢的大家的帮助，我在多观察几天，真不行就在换一种载体。

——————————————————

你的质粒构建没有问题吧!!
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remenb[使用道具]
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发表于 2012-5-18 12:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请问，假如荧光暂时看不到，3-5天以后才能看得更清楚，这期间细胞应该怎么处理？三天换一次液就行了么？还是需要抗性基因筛选？如G418。如能快速回答，不胜感激！
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发表于 2012-5-18 12:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你构建的载体有没有问题？应为有些酶切位点的位置不是3的倍数，需要增加几个碱基的，不然密码子移位，荧光蛋白不能正确表达，细胞自然不会发出荧光了。

转染有两种：1瞬时转染，2稳定转染。如果你要筛选出稳定表达蛋白的细胞株，将质粒整合入细胞的染色体，这时候要拿G418进行筛选，如果只是瞬时转染，检测目的基因能否表达，就不需要用G418筛选。

瞬时转染的时候，一般细胞转染荧光蛋白24小时后，就能发出荧光，48-72小时，荧光强度会增强，因为是瞬时转染72小时后会逐渐衰落。
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49888[使用道具]
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发表于 2012-5-18 12:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
留爪，我也碰到了相同问题。

同时转染，空载没问题，但是装了基因的质粒就是不发光。

序列已经确定没有移码。
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