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标题:[求助]关于细胞培养的污染问题

junjie05[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞还没分出来呢，唉

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细胞死亡率是个大问题，我觉得我的collagenase的浓度还有消化时间还得调整。肝细胞和其他的纤维细胞还有Kupper倒是分出来了，就是HSCs还是少，又不健康。
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发表于 2012-5-18 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看来你已经做的挺多了，星形你有图片吗？细胞大小是不是很小？刚分离出来是怎么鉴定的？
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发表于 2012-5-18 13:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外，你一次杀多少只小鼠，细胞需要冻存到一定数目后再培养吗？
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，你一次杀多少只小鼠，细胞需要冻存到一定数目后再培养吗？

——————————————————

一次杀2只，因为pronase E 很贵
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发表于 2012-5-18 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦 那能看到分到的星形细胞？是小鼠吗？C57？
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发表于 2012-5-18 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/12033417')

请参考这个帖子。还有我的小鼠是BL6
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发表于 2012-5-18 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的小鼠有经过什么处理吗？比如喂养维生素A等。另外你一次分2只小鼠所得的细胞量肉眼能看到吗？你是如何确保无菌的？谢谢！：）

还有，你的protocol中的第7步是什么意思，文献中我也看到了那一步，就是11.5%和GBSS之间的细胞，应该怎么处理呢（肉眼能看到分到的HSCs？）？是小心吸取出来后用GBSS稀释后，1400gX10min吗？这样对细胞损伤会不会很大？多谢！
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发表于 2012-5-18 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的小鼠有经过什么处理吗？比如喂养维生素A等。另外你一次分2只小鼠所得的细胞量肉眼能看到吗？你是如何确保无菌的？谢谢！：）

还有，你的protocol中的第7步是什么意思，文献中我也看到了那一步，就是11.5%和GBSS之间的细胞，应该怎么处理呢（肉眼能看到分到的HSCs？）？是小心吸取出来后用GBSS稀释后，1400gX10min吗？这样对细胞损伤会不会很大？多谢！

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你的小鼠有经过什么处理吗？no
另外你一次分2只小鼠所得的细胞量肉眼能看到吗？离心后能在管子下面看到淡淡的白色的HSCs的沉淀，肉眼。
你是如何确保无菌的？呵呵，这个问题我无法给你回答，毕竟这个是操作，器材等等问题。自己好好检查细胞室的所有使用的东西和步骤，看看哪一步有可能让细菌之类的有机会进入你的培养基当中。
是小心吸取出来后用GBSS稀释后，1400gX10min吗？是的
这样对细胞损伤会不会很大？我不能保证你那边如何，最起码在我的实验室里损伤不是很大，因为细胞还是很健康的。

我也很多地方不是非常清楚，如果有说明错误的地方，请指教。谢谢
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发表于 2012-5-18 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢啦，这周我争取做次实验，到时有问题再请教你了。我前面杀过几十只老鼠，有时一次10只，但是几乎都失败了，都是因为这样那样的原因。
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发表于 2012-5-18 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有问题啊，血细胞污染是怎么处理的？灌流到淡黄色后，取肝的时还是有血回流，肝又变得有点红了，怎么办？450g离心后你看到的血细胞多不多？我前面几次可以看到一层的红色细胞。optiprep你是用什么稀释的，GBSS？
11.5%那层梯度液是什么颜色的？我的是浅黄色的，吸取显微镜观察有细胞，但不能确定，15%那层导是没颜色，也没有观察到细胞。按你的protocol应该是11.5%上面有一薄层是HSCs，介于11.5%和GBSS之间。还有个细节是用50ml的大管进行梯度离心吗？希望能得到你的解答，谢谢！我想把这些问题搞明白了再做实验，否则恐怕又要一错再错了。
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