细胞世界

多谢啦，这周我争取做次实验，到时有问题再请教你了。我前面杀过几十只老鼠，有时一次10只，但是几乎都失败了，都是因为这样那样的原因。

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请问 一次杀10只，你怎么消化阿？几个肝脏放到多少的消化液阿？

还有问题啊，血细胞污染是怎么处理的？灌流到淡黄色后，取肝的时还是有血回流，肝又变得有点红了，怎么办？450g离心后你看到的血细胞多不多？我前面几次可以看到一层的红色细胞。optiprep你是用什么稀释的，GBSS？
11.5%那层梯度液是什么颜色的？我的是浅黄色的，吸取显微镜观察有细胞，但不能确定，15%那层导是没颜色，也没有观察到细胞。按你的protocol应该是11.5%上面有一薄层是HSCs，介于11.5%和GBSS之间。还有个细节是用50ml的大管进行梯度离心吗？希望能得到你的解答，谢谢！我想把这些问题搞明白了再做实验，否则恐怕又要一错再错了。

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血细胞污染是怎么处理的？ 红细胞的比重为1.090~1.092，所以会到15%层。
灌流到淡黄色后，取肝的时还是有血回流，肝又变得有点红了，怎么办？有点血没有关系，毕竟不可能做到100%干净。
450g离心后你看到的血细胞多不多？这个是哪个步骤，我3层离心后，取上层的话，几乎看不到血细胞
optiprep你是用什么稀释的，GBSS？有好几种稀释方式，如果你买optiprep的话，它的说明书会跟着来，稀释液不同的话，比重会不同。
11.5%那层梯度液是什么颜色的？我的是浅黄色的，？？我记得你是用Nycodenz的吧，我的optiprep的11.5%和GBSS之间会看得到淡淡的白色条带。
还有个细节是用50ml的大管进行梯度离心吗？是的。

可以考虑加pronaseE 破坏实质细胞，我是这样的，但是还是有没消化的团块，小心切碎吧，消化的就充分些。

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请问，pronaseE的目的是 破坏实质细胞的吗？

没错，如果感觉贵的话，其实不用也行，只要你组织消化的充分不要让实质和非实质粘附在一起就完全可以根据密度将不同细胞类型分开的。我是用了三种酶，灌流时2种，消化时再加上DNase I。

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你上面提到，pronaseE是用来破坏实质细胞，是不是就是肝细胞？而下面的帖子说 “实质和非实质粘附在一起**分开”也就是用来分离粘在一起的HSCs和肝细胞？不是很明白因为我觉得这2个理由似乎不是一个理由。我倒是倾向于下面的理由，因为 消化的时候肝细胞必然会损伤，然后释放细胞浆内的东西，各种酶和蛋白，比如actin类，而这些蛋白就会使细胞们粘在一起，而pronaseE 本质上作为protease是可以分解蛋白的，所以能够去除那些使细胞们黏附在一起的蛋白的不好的作用。因为别人的论文里似乎没有提到，所以仅仅是猜测，不知道兄弟知道的情况如何？ 谢谢，请指教。

想问下你得到细胞的纯度怎么样？用什么方法检测的？

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很严重的问题，我也正在解决这个问题，hsc倒是能得到不少，但是能看到不少其他细胞。下面的图是我养了4天的细胞，部分已经活化。

前面几天换液应该要离心吧，HSCs应该要几天才能贴壁，如果Kuppfer贴壁时间早的话，就可以通过直接倒出培养基将其去除。看来纯度问题的确是很大的问题，光密度梯度可能解决不了。
你的操作是按AJP或者HEPTOLOGY上面的protocol做的吧，貌似这些文章分到的纯度都大于90%。不知道这些人是怎么分的。

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HSC贴壁在24小时以内，很快的。我也觉得纯度不光靠一次的密度梯度能搞定的。我的protocol是混杂了2个论文上的，呵呵。今天我要修改我的protocol，看看能不能提高纯度。