[求助]关于细胞培养的污染问题 - 经验共享

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标题:[求助]关于细胞培养的污染问题

DDD[使用道具]
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发表于 2012-5-18 17:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

初步判断是霉菌丝状粘成一团然后就是会游动的杆状

junjie05[使用道具]
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发表于 2012-5-18 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我今天染了 alpha-SMA 结果太诡异了，呵呵，出来了大于95%的阳性染色结果。不知道是不是非特异染色结果，还是就是正确的结果。因为这次没有设其他细胞的阴性对照，所以不好解释。下次把肝细胞和其他fibro也一起养，然后做个对照染色看看。这个是第8天的图。

附件

2012-5-18 17:41

77077908.snap.jpg (22.25 KB)

junjie05[使用道具]
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发表于 2012-5-18 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

挺漂亮的，是用荧光显微镜看的吧，不错啊。大概几天能贴壁？几天能活化？

————————————————————————

普通显微镜下看的
贴壁在24小时以内
3-4天开始部分活化，7天左右绝大多数活化。
这个是我养的HSCs的情况，请参考。

glass[使用道具]
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发表于 2012-5-18 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

恭喜楼上的出来好结果。

请问活化的HSC还有实验的价值吗？

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发表于 2012-5-18 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

恭喜楼上的出来好结果。

请问活化的HSC还有实验的价值吗？

junjie05[使用道具]
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发表于 2012-5-18 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

恭喜楼上的出来好结果。

请问活化的HSC还有实验的价值吗？

——————————————————————————————————————————————————————————————

看你关注的是哪个角度了。你是希望研究 HSCs从静态改变到活化状态的过程？还是想看活化后下游事件。。。跟你的方案有关。。价值的话，，我觉得还是有的。
比如，活化的HSC 到胶原的沉积，这个过程的细节。
比如，活化后HSC增殖的调控
比如，对肝细胞凋亡的调控。

要做的工作还是有很多的。。

junjie05[使用道具]
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发表于 2012-5-18 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

细胞粘连问题还是很重要的. 抱着省钱的目的,这次取细胞的时候没有加pronaseE和少加了DNase。梯度离心的时候发现，下层的细胞沉淀明显增多，而上层漂浮的HSCs少了很多，所以，我觉得我的系统中的collagenase的浓度应该没有问题，或者稍微偏大，然后pronaseE和DNase是必不可少的。
一点经验，请参考。

glass[使用道具]
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发表于 2012-5-18 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们这里的离心机有softbrake功能，平时默认的是非softbrake。

设置softbrake之后离心结束后离心机转子会慢慢的停下来，所以离心时间比非softbrake时要长。

设置参考说明书。

junjie05[使用道具]
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发表于 2012-5-18 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

跟Ca2+不知有没关系？最好用有钙的缓冲液溶解。

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细胞和层粘蛋白的结合是钙离子依赖性的，所以一开始第一个灌注液是calcium free 或者含有EDTA，这个是为了更好的消化做准备。但是，接下来加入collagenase后，collagenase的活性是会被EDTA 或者其他螯合剂抑制。而且，在有钙离子的条件下，collagenase会很好的工作。因此，第二个灌注液以及消化液是去除EDTA，加入钙离子的。如果解释有不对的地方，请指正。谢谢

junjie05[使用道具]
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发表于 2012-5-18 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

实质细胞会粘附HSCs，因此没加Pronase的话肯定会有一部分会随实质细胞沉淀的。

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是的，一部分会随实质细胞沉淀的。但是如果胶原酶的杀伤力控制好，别然那么多细胞死亡的话，是否能够防止细胞内蛋白的释放，进而不需要pronase去切掉这些细胞外蛋白呢？我下次想尝试一下消化分3步（10min-10min-10min）来减少细胞死亡，看看是否有帮助。

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