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标题:[求助]下周开始做 小鼠的HSCs 原代培养

duoduo[使用道具]
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终于找到有人提取小鼠HSC了,我们最近也在做,小鼠的不好做。tk57ml 能做出上面这么好的图片非常不错。向你学习。
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Ao7[使用道具]
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请问,为什么不能用1400g的离心去沉淀细胞?本质上,这个操作只不过是为了让所有的细胞都沉淀下来,那么这个离心力只要能够达到沉淀的目的就可以的。400g以上都可以,没有硬性规定,我认为。

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如果这样的话,为什么不用高速离心,比如15000g呢,那样不是可以离心时间更短,更快吗,可是好像一般做细胞的文献上沉淀细胞都是300-600g,太大离心力下细胞会死吧,至于多大算大,我没做过实验,没对比过,1400g是不是大?会死多少?我也不知道,我只是按照一般做法来做的。至于说400g以上都可以,这个说法好像不太准确吧。我们这里其他人做细胞的,有的只用300g,甚至250g离心沉淀细胞,时间稍微长点,应该也有他们一定的道理吧。个人观点。
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49888[使用道具]
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要这么大的离心力吗?我们一般离心细胞就300-500g,还请版主赐教。以前就经常向版主请教,在此先谢过了:)

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我现在所在的实验室前面一个人用的差不多就是这个速度,不过,我最近改到做大鼠的450g了。
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glass[使用道具]
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关于灌注用的酶的浓度和量,有文章认为要根据不同的公司采用不同的浓度和量。 而且很多参考文献中写的浓度和灌注量都有差别。
请教各位, 灌注用的pronase,collagenase以及DNase大家用的是哪些公司的,用的浓度是多大,灌注Rat or mouse时灌注时间和速度分别是多少??
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glass[使用道具]
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另外,这三个酶每次都要现配, 而且用量都很少(几个mg),不知各位是怎么解决准确称量的问题。
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summerxx[使用道具]
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酶的用量,很多文献的说法都不同,pronase的说法是有毒性,collagenase也有文献报道会对某些细胞表面标志有影响,看你需要根据自己的实验决定浓度了。对于小鼠,灌注的速度应该要慢一点,否则,门静脉容易破。总之目的就是把肝脏灌注的烂掉,同时不能压力太大。还要,气泡不能进去,否则灌注效果很差。mg可以用精密天平称取,没有问题。
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pengke1983[使用道具]
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如果这样的话,为什么不用高速离心,比如15000g呢,那样不是可以离心时间更短,更快吗,可是好像一般做细胞的文献上沉淀细胞都是300-600g,太大离心力下细胞会死吧,至于多大算大,我没做过实验,没对比过,1400g是不是大?会死多少?我也不知道,我只是按照一般做法来做的。至于说400g以上都可以,这个说法好像不太准确吧。我们这里其他人做细胞的,有的只用300g,甚至250g离心沉淀细胞,时间稍微长点,应该也有他们一定的道理吧。个人观点。

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是的,离心力大确实会机械损伤细胞。我上面的提问重点只是想说,在合理范围之内,400g离心和1400g离心,结果似乎没有太多的区别(别的细胞不知道是什么情况,最起码小鼠的HSCs上是差不多的,因为2个我都试过了),这个问题类似于到底是400g离心沉淀好,还是500g离心好。个人观点。
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summerxx[使用道具]
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我孤陋寡闻,没看过用1400g沉淀细胞的。不过本文献作者告知,he made a mistake.
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ending[使用道具]
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请教各位高手,提取小鼠原代HSC时,我怎么做才能减少细胞污染?
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fei1226com[使用道具]
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谁做过提小鼠的原代HSCs的,可不可以把protocol发过来共享?
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