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标题:[未解决][求助]请教肝星状细胞的培养

  [未解决]本主题悬赏 可用分 10  
zwsyrt[使用道具]
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发表于 2012-5-19 13:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请教肝星状细胞的培养



我现在正从大鼠肝脏分离肝星状细胞进行培养，遇到一些问题，特地请教各位行家，希望能得到指导：
1.分离肝星状细胞时用的是Nycodenz分离液，11％的终浓度，1400g，17分钟，但分离的效果不是很好，可以见到肝细胞、血细胞等。
2.分离后的肝星状细胞培养时，在培养瓶壁可见很多渣滓，而且可以贴壁，不知怎么可以去除？
3.肝星状细胞的培养我用的是DMEM培养基，10％胎牛血清（杭州四季青），培养时效果不是很好，48小时后仍然没有贴壁，而文献讲24小时即可贴壁。
现在细胞已是处于死亡的边缘。
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  • miracle   2012-5-19 20:59  可用分  +3   鼓励发起讨论，欢迎常来交流！ ...
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2012-5-19 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们的实验室已经可以成功的培养HSC细胞
而且转化成纤维状细胞
对于给你的建议增加转速并且添加溶液防止黏附,
因为我尚在学习阶段,很多细节尚未搞懂,
最近我们甚至在试将HC与HSC同时分离,只是结果并不理想
加油啦
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-5-19 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
刚开始做星状细胞培养，我想请教一个基本的问题，分离星状细胞时的梯度离心使用什么转头，我们实验室只有角度转头不知行不行？
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发表于 2012-5-19 13:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚开始做星状细胞培养，我想请教一个基本的问题，分离星状细胞时的梯度离心使用什么转头，我们实验室只有角度转头不知行不行？

____________________

只能用水平转头！！！
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-5-19 13:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢！我刚开始做细胞培养，对一些基本知识不是太了解，我想请教：洗肝细胞时离心力是50 g，星状细胞是500 g，有的文献报道450 g，分离肝星状细胞时的离心力是1500 g，有的文献报道1450 g，我想问：这些离心力是否代表细胞的特性，实验过程中不能调节，如果偏离这个离心力，得到的是否不是这个细胞呢？
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发表于 2012-5-19 13:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
由于肝细胞体积较大，因此50g离心力就可以将其沉淀，而500g是为了沉淀所有的肝脏非实质细胞，而并非只是星状细胞，按我的理解，500g/450g差别应该不大，但是我做分离的时候，发现即使用500g离心10min，也不能将所有的细胞都沉淀下来，不知是不是我的操作有问题？
而梯度离心时的离心力较为重要，因为它涉及到细胞分层的问题，但是我查阅文献发现，不同作者所用离心力也不同，大部分所用离心力是1400g，17min。
以上是我的粗浅见解，不一定正确，愿与各位探讨。
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发表于 2012-5-19 13:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我说的都是理论上的，有生搬硬套之嫌，特向大家请教。
离心转头一般分为三种类型：固定角式（FA）、直角离心转头（VT）和水平离心转头（SW）。
我在吴冠芸主编的《生物化学与分子生物学实验常用数据手册》中查到：对于沉降速度离心，SW颗粒经过途径长，分离效果最好，FA次之，VT最差。
对于等密度梯度离心，以VT分离效果最好，需要的离心时间最短，SW分离效果最差，离心时间长，不能用太高速度。所以密度梯度离心时，一般不用SW，常用VT和FA。（第9章：超速离心 P89）
我们在分离星状细胞时所用方法正是密度梯度离心，因此，我认为可以选用FA转头，而且效果应该校SW好。
可惜的是，在细胞分离的论文中作者均没有注明所用转子的类型，也可能这是一个很简单的问题，只是我们还不了解。
以上愿与大家探讨。
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发表于 2012-5-19 13:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我说的都是理论上的，有生搬硬套之嫌，特向大家请教。
离心转头一般分为三种类型：固定角式（FA）、直角离心转头（VT）和水平离心转头（SW）。
我在吴冠芸主编的《生物化学与分子生物学实验常用数据手册》中查到：对于沉降速度离心，SW颗粒经过途径长，分离效果最好，FA次之，VT最差。
对于等密度梯度离心，以VT分离效果最好，需要的离心时间最短，SW分离效果最差，离心时间长，不能用太高速度。所以密度梯度离心时，一般不用SW，常用VT和FA。（第9章：超速离心 P89）
我们在分离星状细胞时所用方法正是密度梯度离心，因此，我认为可以选用FA转头，而且效果应该校SW好。
可惜的是，在细胞分离的论文中作者均没有注明所用转子的类型，也可能这是一个很简单的问题，只是我们还不了解。
以上愿与大家探讨。

————————————————————————————————————————————————————————

我一直使用水平转头，再则分离HSC时梯度离心速度并不高，且时间虽长但（由于速度低）对细胞损伤小。
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发表于 2012-5-19 13:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我要做小鼠胎肝干细胞的培养，有几个问题要请教。
取出组织后消化时用什么消化酶，浓度如何？时间呢？是一次消化还是分次消化效果好？离心时转速时多少，多长时间？
望赐教。
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bohe221[使用道具]
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发表于 2012-5-19 13:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我使用的原代分离方法,仅供参考.

1.1动物准备 雄性SD大鼠，体重500g左右，常规饲料喂养，正常饮水。在分离HSCs前2周每天VitaminA 200IU/100g体重胃管内注入。
1.2. 主要试剂与仪器
1.2.1试剂：Collagenase IV、PronaseE、鼠型VEGF、DNaseI购于（Sigma公司），RPMI1640培养基、胎牛血清、马血清、Percoll购于（GIBCO公司）。
1.2.2仪器：Nikon倒置荧光显微镜（Nikon公司）、BeckmanGS－15R离心机（Beckman／Culter公司）、MilliQ净水仪（MilliPole公司）、Therm培养箱（Therm公司）。
1.3肝星状细胞的分离与纯化 分离当日氯胺酮0.2ml/100g体重、肝素150IU肌肉注射麻醉后，严格消毒。置于无菌超净台，仰卧位固定。开腹后门静脉插管灌注。具体操作如下：取大十字切口，上至剑突，下至耻骨联合，左右至两侧腋中线。皮瓣外翻，显露腹腔所有脏器。将小肠翻至鼠体左侧，可见肝门处门静脉由脾静脉和肠系膜静脉汇合而成。在双肾静脉上方游离肝下下腔静脉。肝上游离肝膈面，下压肝脏剪断镰状韧带至肝上下腔静脉。将9号输液针插入门静脉，动脉夹固定，转动灌流泵。同时迅速钳夹肝上下腔静脉，剪开事先游离好的肾静脉上肝下下腔静脉，整个原位灌流过程开始。
首先使用加葡萄糖1.0g/L、肝素5000IU/L的D-Hank’s液200ml，水浴加热至39℃，流速为20ml/min。尽量将肝脏内淤积的红细胞冲出。然后使用酶灌注液，0.05mmol／LCa2＋、0.05%CollagenaseIV、0.08％PronaseE、4.8g／L HEPES（pH7.4－7.6）、5％FCS-HI的D-Hank’s液100ml，流速为5ml／min，消化肝脏。20分钟后使用无菌剪刀将肝组织剪下放入洁净的培养皿中，进入细胞室进行以下操作。在培养皿中去除肝包膜和Glisson鞘。将肝脏粉碎成糊状，放入0.05％CollagenaseIV、0.001％DNaseI和5.3%FCS-HI(V/V)的PBS中，37℃水浴摇动30分钟，使肝组织充分得到消化。将消化好的肝组织过100目钢丝筛，未能通过的肝组织用玻璃注射器针芯研磨，RPMI1640培养液冲洗。滤过的肝组织放入50mlFalcon离心管中，加RPMI1640培养液至50ml，20℃100x g离心5分钟，去除大部分肝实质细胞。上清转入另一Falcon管中350x g离心10分钟。取沉淀重悬于50mlRPMI1640培养液中，再次350x g离心10分钟。沉淀重悬于16ml的PBS中，分两份分别加入已经铺好梯度的Percoll的顶层。Percoll的密度梯度分为3层：由上至下依次为20％（密度~1.012 g/ml）20ml、35％（密度~1.014 g/ml）15ml、50％（密度~1.018g/ml）10ml。铺好后4℃900x g离心30分钟。轻轻取出，不要摇动液面，可见在20％Percoll层中间有一混浊带。用16号针头插入液面下此处抽吸约10ml。加RPMI1640培养液至50ml，900x g离心10分钟，沉淀重悬于10ml左右RPMI1640＋199混合培养液中，内加入10％胎牛血清和10％马血清以及10ng／ml的VEGF等。计数细胞产量并且行台盼蓝拒染试验，判断活力。
1.4 细胞培养 重悬细胞计数后按1.5x106／孔接种于铺被胶原S的24孔板。10分钟后重吸细胞混悬液入新孔。3天后首次换液，以后视情况每2－3天换液一次。如需作免疫组化等分析，可将细胞接种于内有玻片的6孔板中。细胞融合达到80％－90％左右可进行传代。传代时常规使用0.125％胰酶。
1.5细胞鉴定 细胞纯度鉴定在3天后细胞显现梭形形态时，使用高倍镜每孔随机选择10个视野，每个视野至少计数200个细胞。325nm波长紫外光激发细胞自发荧光。光镜、透射电子显微镜观察细胞形态。免疫组织化学方法鉴定原代HSCs和传代HSCs Desmin、α-SMA的表达情况。
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