[求助]黑胶虫? - 经验共享

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标题:[求助]黑胶虫?

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发表于 2012-5-19 17:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

梭形有两个分支的是我的细胞，小的黑点是可能的黑角虫，其余的应该是培养瓶里面的脏东西。

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发表于 2012-5-19 17:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的是肿瘤细胞
细胞室有很多人的细胞，不可能让他们都冻存。我只是把我的有问题的细胞扔了，没有问题的继续培养。之前用的试剂继续用，也没有问题。
我觉得不是传染性的，是细胞本身状态的问题

utt0989[使用道具]
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发表于 2012-5-19 17:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先看一下培养液的颜色，在二氧化碳孵箱中，培养液的颜色为淡黄色，如果变为淡红色就可能为污染
其次看细胞生长状态，细菌污染后细胞形态不佳，类似泡沫样或者破碎凋亡表现
三高倍镜观察黑胶虫比较小，运动慢，繁殖慢，对细胞影响较小，而污染细菌，可见大量杆状或球状黑点快速布朗式运动，有时可以穿梭细胞，而黑胶虫主要在细胞间隙慢动
以上是自己的一点经验，仅供参考，我也是初学者，大家共同学习吧

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发表于 2012-5-19 17:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

明明是高手不必谦虚，以上三种污染我都遇到过，就是死活不知道是什么东西呀，现在算是明白了。不过还有一种，好像贴壁，都不动，有点像网状，不规则的那种，可以看到交联，搞得整个培养液的背景很脏！不知道是什么东东啊。

utt0989[使用道具]
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发表于 2012-5-19 17:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

细胞培养之黑胶虫
（一）、黑胶虫概况：
细胞培养时，显微镜下看到许多小黑点在动，主要在细胞间隙，运动形式为在原地振动（类似布朗运动），这种小黑点既不是细菌、霉菌，也不是支原体，一般称其为“黑胶虫”。
1、黑胶虫是什么？多数人认为黑胶虫是存在牛血清里的一种寄生虫，一般的合格血清里不会存在细菌、霉菌及支原体等微生物，之所以说黑胶虫是生物，因为它会不断增多，达到一定数量时会与细胞竞争性生长，与细胞竞争培养基中的营养，从而使得细胞营养不足而死亡。
1.1不管对于黑胶虫的争论如何,但有几个是目前大家公认的：
① 与细胞竞争性生长，对细胞生长有不利影响。
② “黑胶虫”会增殖，增殖多时，视野下一大片都为“黑胶虫”。
③ “黑胶虫”与血清有关，与血清质量有很大关系。
1.2目前对“黑胶虫”的定论：有2种解释：
第一，黑胶虫为生物。
牛血清中寄生虫-----它是小于细菌的生物，直径小于0.1μm，大多国外血清中多见，可能是国外牛血清中含有的某种原虫。黑胶虫属于寄生类的原虫，而不是细菌、支原体，也不是什么补体、细胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍镜下可以清楚的看到胶虫有两种不同形态。这种生物也并非离开细胞就不能存活，也有人做过这样的试验，单纯培养过污染胶虫的血清4周，直到满视野都是黑煤渣般的胶虫。给人的感觉是胶虫和细胞一样有丛集性，如果胶虫密度低则生长缓慢，如果手懒，拖了几天没换液，待胶虫生长到一定浓度后便会飞速分生，细胞受感染的程度也大，这时除了培养基中可见外，细胞表面通常也象长满了粉刺。据说，中国病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。由此黑胶虫属于原虫的有比较大的可能性。就目前信息来说，持有此见的人最多。
支原体说-----有人曾认为黑胶可能是支原体污染，因为有文章指出，黑胶虫可以通过滤膜，可以在空气中传播。而恰巧口腔支原体为人体口腔中之正常菌丛，所以实验室之操作人员的污染亦可能为支原体的污染源。但有人为此做了实验证明黑胶虫不会是支原体，原因如下：
1、光镜下可见, 因为体积不对，支原体在普通显微镜下不能看到。
2、多种染色后可见，甚至hoechst即能将它染色,一般来说支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。所以，黑胶虫是一种支原体的可能性比较小。
真菌说-----有很多人发现类似黑胶虫的微生物，但最后确定是真菌，二性霉素B对其有效。所以黑胶虫是一种真菌也是不太可能。
第二，黑胶虫不是生物。
血清聚合物说--------国内的血清中，通常灭活之后都会有絮状沉淀出现，而黑胶虫出现时，所使用的血清被反复冻融过多次。所以推测，所谓的“黑胶虫”其实就是血清中的某些蛋白成分的物质，经过灭活之后丧失活性，在培养基中，镜检见到的运动其实是这些物质在溶液中做“布朗运动”。随着细胞消耗培养基，这些物质越来越多，最后细胞所用的营养消耗完，细胞容易死亡。gibco公司的血清说明，此物为血清聚合产物，而不是微生物
硅颗粒说------网上有文章说，黑胶虫其实不是一种生物，是无机物，其本质是玻璃培养瓶里的硅颗粒。可影响细胞生长，细胞状态好时，不明显。细胞状态较差，数量少时才容易看到，最好的办法是用一次性培养瓶，可消除黑胶虫影响。
细胞碎片说------在细胞培养的时候，由于细胞代谢、物质交换、周边环境变化，尤其是在从37度培养箱中拿出来观察的过程中，由于液体培养基的比热较大，液内温度高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，当然这些小岁末就会被搅动起来形成似乎“游动”的感觉；随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂，破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和残渣的出现；再者，“黑胶虫”问题是很多细胞培养者已经发现的问题，但到目前为止尚未找到其监测和排除的试剂和手段，这首先是由于所谓“黑焦虫”病原体根本难以收集和捕捉，这也从另一个侧面证明了“黑胶虫”问题的难以确定性；再说任何一种外来的微生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单地运动那样的外观性表现。举一个例子：如果“黑焦虫”的运动状况已经到了用显微镜已经可以观察出的程度，其营养代谢和能量需求也就可想而知。这样，培养液中的影响消耗、酸碱含量程度等都要发生明显变化。比如说：迅速的、大含量的沉淀， pH值的迅速下降，细胞大量破碎死亡、引发其它类型微生物侵染等等。而这些状况，在所谓的“黑焦虫”感染中，是很难观察到的。同时“黑胶虫”的出现而影响细胞状态似乎得不到有力的证据。倒是细胞状态下降的时候，“黑胶虫”明显增多了。很有可能是细胞状态下降时，细胞衰亡产生的细胞碎片。所以黑胶虫属于细胞碎片是不失为一中可能的解释。

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发表于 2012-5-19 17:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

2、黑胶虫--------纳米细菌
芬兰科学家Ciftcioglu et al 在其细胞培养过程中, 发现在胎牛血清中存在一种直径50-500 nm的微粒; 这种颗粒物对伽玛射线具有很强的耐受性; 针对包括支原体在内的所有已知微生物的特异性检测实验均为阴性; 这种颗粒物在血琼脂培养基以及支原体培养基中无法生长, 通常的细菌染色方法难以着色. 因此, Kajander判定这是一种新的微生物, 根据其体型微小并且栖息在血液中的特点, 将其命名为Nanobacterium sanguineum, 简称Nanobacteria, 中文译名纳米细菌, 并将菌种保存于德国微生物存储中心 (DSM No: 5819-5821, the GermanCollection of Micro-organisms, Braunschweig, Germany).
2.1纳米细菌的生物学特性---------哺乳动物体内最小的细菌
细胞培养时所使用的血清通常采用过滤法达到无菌的目的, 通常采用直径0.1 μm的滤膜过滤除菌. Kajander研究发现, 0.1 μm的滤膜过滤并不能有效地清除血清中的纳米细菌, 但是血清经过0.05 μm的滤膜过滤则能有效清除纳米细菌污染. 细胞培养条件下的纳米细菌经过0.2 μm的滤膜过滤后约有3%的纳米细菌可以通过滤膜, 而在加压过滤的情况下, 约有50%的纳米细菌可以通过0.2 μm的滤膜. 刚刚经过过滤的纳米细菌在相差显微镜下无法发现, 但在不含血清添加剂的细胞培养液中培养24 h后, 即可以用相差显微镜观测到. 电子显微镜观察显示, 纳米细菌的平均直径为200 nm, 而子代纳米细菌的最小直径仅50 nm. 传统的观点认为, 只有当细胞直径在不低于140 nm时, 才能维持其最基本的新陈代谢. Kajander认为, 纳米细菌可能是地球形成早期、在原始大气条件下的一种最原始的生命形式, 因此不能用衡量已经经过几十亿年进化的生命形式的观点去衡量这种古老的生命形式, 并且推测, 纳米细菌遭受不良因素的侵害后可以形成许多的体形微小的碎片, 并将其释放到环境中, 每一个碎片都可能携带部分遗传信息, 在特定条件下, 这些"基本"颗粒聚集在一起形成群落, 当足够数量的"基本"颗粒提供完整的遗传信息时, 则可以形成新的纳米细菌.
2.2 纳米细菌缓慢的增殖周期
微生物学家通常是通过对某种微生物进行培养, 进而了解该种微生物的特性. 然而, 并非每种微生物都是可以在实验室中进行培养的,主要原因在于这些微生物的培养条件我们并不清楚, 其生存环境以及是否与其他微生物存在共生关系我们并不十分了解. 纳米细菌就是一种对生长环境要求非常苛刻的微生物, 其新陈代谢率极为缓慢, 仅为普通细菌的1/10 000. 研究发现, 纳米细菌主要利用环境中的氨基酸而不是葡萄糖来提供能量, 谷氨酰胺、天冬酰胺以及精氨酸均可被其利用. 在37 ℃有50-10 mL/L的二氧化碳及900-950 mL/L的空气存在的潮湿环境下, 并且在含有100 mL/L胎牛血清和适量谷氨酰胺的pH值7.4的细胞培养基中, 纳米细菌能够缓慢生长, 平均倍增时间为3 d,而在无血清的细胞培养基中, 其增殖速度变慢, 细菌倍增时间可延长至5-6 d, 在添加适量促纳米细菌生长因子BGF(一种杆菌培养上清的超滤液)或N3(纳米细菌培养上清的超滤液)的条件下, 其增殖速度加快, 倍增时间可缩短至0.6-1 d. 在有促纳米细菌生长因子BGF存在的条件下, 纳米细菌甚至可以在固体培养基中生长, 并形成直径l mm大小的细菌集落.
2.3 纳米细菌独特的生物矿化现象
当在含血清的培养基中培养的纳米细菌被转移至不含血清的培养基中继续培养时 (DMEM或RPMI-1640), 在1 a之内就可以观察到纳米细菌出现贴壁现象, 在1 wk之内, 就可以在纳米细菌的周围形成几微米厚的生物被膜 (biofilm), 并且紧紧贴附于培养瓶底部, 而纳米细菌栖息其中(这与在含血清培养基中培养的纳米细菌的形态明显不同), 此时其大小接近于一个酵母细胞, 2-3 wk以后, 由于生物被膜的增厚, 其直径已近似于一个红细胞的大小. 用EDX法对这种生物被膜的化学组成进行分析, 显示其钙磷的峰值与羟基磷灰石极其相似, 电子显微镜观察以及傅立叶转换红外频谱(fourier transform IR spectroscopy, FTIR)分析显示其主要成分为碳酸羟基磷灰石(carbonate hydroxyapatite), 而且,不论在有无血清作为添加剂的情况下, 都可以见到这种被羟基磷灰石包绕的纳米细菌, 这种情况甚至可以在处于分裂期的纳米细菌中见到. 纳米细菌并不产生尿激酶和碱性磷酸酶, 并且即便经过长达数周的培养, 其培养基的pH值也不会出现明显的变化, 一直稳定在7.4左右, 这表明在纳米细菌细胞膜表面所生成的羟基磷灰石结晶是源自于生物大分子的, 即生物矿化现象, 而并非是由于pH值改变所导致的简单的物理结晶现象.纳米细菌利用培养体系中的钙、磷合成羟基磷灰石作为其生物被膜的主要成分, 这种生物矿化过程受到生长环境中某些因素的调控, 从而使其呈现不同的外观, 如羟基磷灰石形、细菌被膜形、沙粒形、结石形和类似肿瘤的外形. （这也许就是国内的一些研究者们认为其是一些磷酸盐类的无机物的部分原因吧！）。在含有新鲜血清的培养基中纳米细菌的生物矿化现象程度较轻微, 这是由于血清中含有强效羟基磷灰石合成抑制因子, 骨钙素 (osteocalcin) 和胎球蛋白(fetuin), 由于这些抑制蛋白的存在, 所以在有血清存在的情况下, 纳米细菌的生物矿化作用受到明显抑制. 当血清浓度降低时, 纳米细菌的生物矿化现象增强, 在不含血清的培养体系中, 生物矿化现象剧烈而迅速. 尽管改良的Loeffler固体培养基中含有750 mL/L血清成分, 但血清蛋白成分在灭菌过程中受到破坏, 所以在此培养基中的纳米细菌的矿化作用并不受抑制, 在此培养基中生长的纳米细菌其菌落直径可达1-5 mm. 另外, 当有乙二胺四乙酸(EDTA)存在时, 纳米细菌的生物现象会受到明显的抑制.由于矿化生物被膜的保护作用以及极其缓慢的新陈代谢率, 使纳米细菌能够耐受各种不利的物理条件和化学损伤因素以及多种抗生素的打击.

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发表于 2012-5-19 17:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

2.4纳米细菌的检测方法
由于纳米细菌在标准微生物培养基中无法生长, 并且即便是在最适宜其生长的细胞培养环境中, 纳米细菌的生长也极为缓慢, 其新陈代谢率仅为普通细菌的万分之一, 这使得许多基于检测细菌新陈代谢的微生物学方法无法检测纳米细菌的存在. 由于纳米细菌难以用传统的火焰法和乙醇法固定, 并且大多数染料无法穿透其细胞壁, 而且不能用普通显微镜对其进行观察, 因此常规的细菌学染色法并不能检测到纳米细菌的存在. 通过Kajander et al 的研究, 发现70℃干烤10 min, 可以将其有效固定; 另外, 用茜素红S、刚果红以及硝酸银染料可以使纳米细菌着色; 而培养状态下的纳米细菌可以在放大400倍的相差显微镜下清晰地观察其生长情况; 用DNA荧光染料 (Dapi或Hoechst) 按普通细菌DNA染色的条件对纳米细菌DNA进行染色均不成功, 而当按照线粒体DNA以及病毒DNA染色条件, 对纳米细菌DNA进行染色时, 荧光显微镜下可以观察到特征性的荧光; 用纳米细菌特异性抗体进行荧光染色也可以清晰地显示纳米细菌的存在; 利用电子显微镜对经过负染的纳米细菌进行观察, 可以清晰的显示80-350 nm大小、单独或聚集成簇的纳米细菌以及其表面的生物被膜(biofilm)结构; 而用透射电镜对纳米细菌的超薄切片进行观察, 可以清晰的显示其内部结构。
（二）黑胶虫出现的条件和影响因素
1.“黑胶虫”的出现常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。就是在细胞生长状态不良时，黑胶虫容易出现。“黑胶虫”生长与细胞的生长有此消彼长的关系，即当细胞状态好时小黑点会相应的减少；反之则增加，似乎有细胞竞争生长的关系，但总的来说它的出现似乎并不影响细胞的生长。
2.细胞刚用的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，小黑点一般不出现，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长。细胞进过多次传代的情况下，也会使黑胶虫出现。
3.换用了其他公司的血清，就出现了这种非常类似这里的”黑胶虫“的情况。其实在很多遭遇黑胶虫的案例中，大部分细胞培养者都认为黑胶虫来源于血清。
（三）黑胶虫对细胞的影响
多数人观察到黑胶虫开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度，大量繁殖时可以明显影响细胞的生长状况，甚至细胞大量坏死，干扰试验的进行，因此有必要采取一些方法杀灭或者抑制其生长，将其对细胞的影响减小到最低。其实黑胶虫不是细胞实验的关键，应该严格无菌操作，尽量避免细菌真菌的污染。
（四）对于“黑胶虫”的处理方法：
1、杀灭黑胶虫的方法
紫外照射、甲醛高锰酸钾熏蒸这些方法对“黑胶虫”的确切效果尚不可知，如果其为牛血清中的某种寄生虫，这些方法也没有多大效果，毕竟上述方法主要针对空气中的微生物。有人实验显示新洁尔灭与水或培养基的比例为1：4时即可杀死“黑胶虫”，因此可以用新洁尔灭来喷洒或擦洗用于实验室或培养箱内消毒。
2、血清处理
第一，血清灭活买回来血清灭活前应采用逐步解冻法，即按照-20℃—4℃完全融化室温回温，再置入56度水浴中，这样的目的是避免温度骤变，导致血清中的营养物质丧失活性，另外可以轻轻摇动，使瓶内液体温度均匀，可以减少絮状沉淀形成
第二，血清灭活后可以分装保存。按照每次用血清的量分装，尽量减少血清冻融的次数。分装时注意无菌。细胞培养时血清浓度稍大一些。通常细胞培养血清浓度为10%-15%，但如果血清冻融次数过多，那营养物质丧失活性，按15%的浓度配制事实上达不到15%的营养成分，故培养基配置时一般用18%-20%的血清。
3、换用进口的一次性塑料培养瓶，若实验条件较好，可以采用
4、停止复苏，停止养细胞，清理无菌室物品，重新灭菌，用甲醛-KMnO4熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏。感觉这样做没有多大必要，平时注意实验室卫生，每1-2用新洁尔灭擦拭地面桌面即可。如果是细菌污染，而且反复检查找不到原因，就应彻底消毒所有用于细胞培养的一切用品，包括所用的培养瓶，培养基，吸管，胰酶，孵箱，超净台、空间等等你能想到的和细胞培养相关的所有物品。一个星期后，再复苏污染之前冻存的细胞，注意白大衣衣袖污染，可以在紫外线照射前将其充分展开照射。
5、贴壁细胞，在每次传代或者换液前可用无菌的PBS或者D-Hanks液洗1次，若瓶内感觉较脏，可以多洗几次，另外回温的缓冲液比冷的缓冲液洗脱黑胶虫的效果好。

（五）、总结
1、黑胶虫可能是牛血清中的一种寄生虫
2、在判定黑胶虫污染前首先排出细菌真菌污染，可以从培养液、细胞形态和行为、高倍镜检三个方面观察判定，此不赘述。
3.尽管黑胶虫对细胞实验有一定的干扰，采取适当的措施可以减少其影响，感觉用回温的D-Hanks液冲洗效果较好。
上述中文字是在参照百度、丁香园诸多高手及热心网友的文章，结合自己的一点教训汇集而成，没有具体写明出处，敬请见谅，此处谢过。在丁香园上学到不少东西，看到一些有关黑胶虫的讨论，因此汇成此文，供大家参考。言语不周，词不达意之处，还请各位指正。

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小中大

我养的是肿瘤细胞，以前也遇到过类似这种问题，以为是黑胶虫，后来发现是其他一些设备的问题，后来细胞自己调整过来了。我觉得黑胶虫应该是一个排除诊断，等你把其他问题都排除了，才考虑是否是黑胶虫的问题。

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小中大

我在养一种C666肿瘤细胞，我用24孔板养的，培养条件是15％Hyclone 胎牛血清，含双抗的1640血清。第一次传代前长得很好，传代后第二天培养液变黄，显微镜下看见了很多小点，会在原地抖动，有些是两个短杆状连在一起，有些是逗点状，微调显微镜有折光性。大多数在细胞外，细胞内看不出这种小点。但是细胞质内有空泡，形态变得不规则，与原来相差很大。有很多死细胞飘起。我连续每天换培养液，直到三天后才看不见这些小点。以前有空泡的细胞可能被洗走了，没有看见。以前形态好的细胞留下，继续生长，传代后第五天长得不错，大概长到孔的50—80％满。我刚开始怀疑是细菌感染，把1640，血清，胰酶分别拿出来培养，但是三天后1640，胰酶仍然很澄清，血清也在显微镜看不见细菌等异常东西。
第七天，我对细胞再传一代，传代后这些小点又出现了。情况跟之前一样。
我不敢肯定这是细菌，还是黑胶虫。拍了一张图片，请各位高手指教！

附件

2012-5-19 17:58

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huifeng0516[使用道具]
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小中大

你养的是什么细胞？我做大鼠外周血淋巴细胞提取，每次刚做完两三个小时就出现黑色的短棒状的虫子还会动。。不知道是什么污染。。。

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估计是杆菌！

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