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标题:[求助]如何取乳鼠心脏?定位?

园丁##[使用道具]
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在取乳鼠心脏时最好不要让其死亡,如果在酒精中泡的时间太长酒精会进入乳鼠的消化道和呼吸道,这样是不好的,再有就是死后的乳鼠取心脏时不容易取,而如果是在活体的状态下取时可以很容易的找到搏动的心脏,且此时心脏的活性也是比较好的。我平时就是用镊子夹住再酒精里过一遍,固定好乳鼠后再用酒精棉球擦一遍。
用两把眼科镊子(眼科弯镊最好)夹住皮肤分别向头和尾的方向一撕就可以把皮完整的撕开,并且可保证第一套器械不接触皮下的肌肉。在剑突左侧剪一十字形状的口。用两把眼科镊或一把眼科镊和一把眼科剪就可以取下心脏。实现准备好一高压消毒好的的培养皿,内放冷的PBS,取下的心脏放入其中。时间要尽量的短,最大程度的保证消化后的细胞活力。然后转入超净台。剩下的就是消化过程了。酶的浓度,消化的温度和次数,是吹打消化还是搅拌消化或振荡消化…….论坛里有关于乳鼠消化的一些注意事项。可以搜一下,对比自己的看看。
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flower-201[使用道具]
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我和你出现的问题一样一样,所有东西换了个遍,还是一样,郁闷中。。。。。。。
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jrwyyplt[使用道具]
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我的问题跟你完全一样的,我现在所有环节都排除了一遍,还是没有找到原因,我看了上面的怀疑是手术时打开了腹腔导致污染
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jrwyyplt[使用道具]
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我手术时心脏基本上是在搏动情况下取的,但是细胞还是在第二天开始死亡,也只有半数贴壁,还有大量小黑点在做布朗运动
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细菌污染2-3天培养基会混浊,镜下大量细菌,我的没有啊,但肯定是微生物因为新洁尔灭去完元代加进去,那些小黑点就不动了,到底是什么?请问楼上你和我的一样吗?
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园丁##[使用道具]
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保持心肌细胞活力好的办法:一个就是取材时的时间要尽量的短,另外在分次消化时要把握好消化的时间,防止胰酶对心肌细胞的损伤。再者就是注意无菌的操作了,因为做一次心肌细胞培养的时间很长,大概要3个小时多,期间很容易污染。关键是多做几次,更换不同的条件,摸索好适合自己的消化条件,同时在取材、消化、终止、离心、接种各方面注意无菌操作。另,取心脏时尽量不要打开腹腔,防止污染。
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我的差不多是在点板后几个小时开始出现小点,我仔细看了一下,这些小点不停的抖动,会推动细胞,使细胞无法贴壁,我做了5次了每次都有这种小黑点,细胞状态会越来越差,大部分无法贴壁,更别提搏动了,我的胰酶,培养基都是跟人混用的,都可以排除,我只能认为是消化时用的玻璃器皿的问题,这些我是洗液浸泡过夜,高温灭菌的,出问题的几率很低,我现在也找不到原因,头疼死了
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jrwyyplt[使用道具]
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我的是小亮点,在100倍镜下观察,像沙子一下,看不清具体形态,我调到400倍镜下看,是圆形小亮点,跟细胞差不多颜色,体积比细胞小很多,没有核,做布朗运动,包围细胞,使细胞无法贴壁, 这种小点以出现,细胞就无法贴壁,而且小亮点会越来越多,现在也不知道这是细胞状态不好的产物还是这些小亮点导致细胞状态不好
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jrwyyplt[使用道具]
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园丁##,你说的注意点我都做过了,而且请了人来看我的操作,确认没有问题,人家也是用相同的操作的,但是我的细胞始终无法贴壁,原因应该是这些小点出现,但是实在不知道是在哪个环节引入的,不知道有没有战友遇到过这个问题
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园丁##[使用道具]
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回复 #19 jrwyyplt 的帖子

这种情况确实没遇到过,你说小点会不停的抖动,还会推动细胞,使细胞无法贴壁。我确实不知道什么原因。
另,差速贴壁后是否进行了台盼蓝计数,大致看一下死活的细胞数目,是否是消化的原因导致细胞状态活性不好,从而无法贴壁。消化时是否用的多次消化。
另外是不是材料的原因,可换用SPF级别的乳鼠做一次排除一下这方面的原因。再看看其他战友的建议。
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