[求助]我培养的神经元为什么没有突起啊? - 经验共享

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标题:[求助]我培养的神经元为什么没有突起啊?

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发表于 2012-5-21 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

神经元在接种后一天后该是长轴突了，因此不能确定视野中的细胞是神经元还是杂质细胞。
无血清培养基不利于细胞贴壁，可以第一天用含血清的培养基孵育过夜，第二天再换成neurobasal 试试。
时间比较长了，胰酶的浓度应该跟其活性不太成比例了，最好重新配制，不过胰酶可以高压吗？会不会在高压过程中失活？

tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-5-21 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是用0.01％的L-多聚赖氨酸包被的，刚开始贴壁还可以。胰酶我已经重新配制了，用注射滤器过滤除菌，没高压。

kswl870[使用道具]
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发表于 2012-5-21 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看你的图片，有些模糊，我的感觉是你的图片里的神经元很少，或是有就是没活性的，应该是神经元可看到细胞核，且周围的光晕很好。我一直做大乳鼠的原代培养，培养基没有你的好，但神经元种的还是很好的。种植的神经元在6小时就可以贴壁，长出突起，24小时后，基本都贴壁了，若漂浮的神经元为活性丧失的，通过换液可以移除。
4只乳鼠的皮层组织，我用的胰酶0.25%，稀释为1：8（Dhank's 液），若乳鼠多了，胰酶可用1：7稀释，事先37度水浴箱预热（无菌操作），保证胰酶的温度为37度。取脑组织是在冰袋上平皿里4度的Dhank's 液中减为碎块的，倒入试管里冰袋上静置，取出上清液（取的干净些），此时离开冰袋，加入胰酶，量在5-6毫升，机械吹打力度要适当，见有浑浊时，立即用全培2-3毫升终止，混匀。静置后，取上清过100目尼龙网，用同样的毫升的Dhank's 液回收两次的上清，离心1000r5分钟，弃去上清，用15全培混匀沉淀细胞。
这是我种的四天的细胞，你可看看

附件

2012-5-21 16:33

14293894.jpg (27.71 KB)

tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-5-21 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的神经元图片确实不错！挺羡慕的！
我发完贴后，又做了一批，胰酶和多聚赖氨酸重新过滤了下，取材时间也较前缩短，却污染了！真郁闷！
我的分离脑膜、夹取皮层是在解剖显微镜下操作的，由于解剖显微镜由于比较大，只好放在超净台外面，比较危险！之前同样在外面操作、且时间较长，却没有污染，真奇怪！养神经原细胞怎么这么难的呢？
一般取材时间（从断老鼠头到接种到培养瓶）多长时间为好啊？我用了快三个小时，这和神经元无突起不知道有没有关系？

wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-5-21 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

无菌操作很重要，但你的培养基里有双抗，应该不容易污染的。
时间操作久没关系，我第一次种的时候就用了4小时。
说几点吧，看能不能帮你
1无菌取脑：在超净台内，直接剥离脑血管膜，显微眼科镊，可以整片脑膜剥离。
2Dhank's 液的PH值7.0（见你写的过程中，不知道是在什么溶液中剥离脑膜的，若剥离太久，细胞失去内环境液体也会损伤细胞活力的）
3胰酶作用的浓度0.25%（见前我说的稀释）
温度（保证37度，不能超出37度）
时间（加入停留2分钟）
另胰酶使用的时间不能太长，不能反复冻融
4机械的吹打（吹打的试管口要用酒精灯烧圆，不能有割口，会划伤细胞），力度适当，大约在20-30次，见浑浊就用全培终止消化
5多聚铺皿，过夜收起后，可用DMEM或三蒸水清洗一次，再种植细胞。另多聚有使用期限的，过期也会铺皿无效。

别着急，成功一次，你就有种细胞的感觉了

tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-5-21 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在你们的帮助下，我神经元总算养出来了！
这是我培养第六天的皮层神经元。我有一个疑问还想请教一下过往的各位老师，我的神经元已经培养快六天了，视野下，仍可见有很多亮点样东西，以细胞聚集处明显（如图红圈内）。不知道是什么东西？我这次种的密度有点大。

附件

2012-5-21 16:34

82181433.snap.jpg (32.63 KB)