小中大显微镜下观察之“小黑点”:通常经过热处理之血清,沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”,常会误认为血清遭受污染,而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“,但在37℃环境下,又会使此沈淀物增多,更会误认为微生物之增殖,但以培养细菌之培养基检测,又没有污染。一般而言,此小黑点应不会影响细胞之生长,但若怀疑此血清之品质,应立即停用,更换另一批号的血清。
附-血清之生长测试
材料:
MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )
6-well TC plate (or 35mm TC dish)
methanol
glacial acetic acid
10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)
步骤:
1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80% confluency。
2. 以trypsin-EDTA 处理细胞,离心后,加入适量不加血清之a-MEM 制成细胞悬浮液,并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1×102活细胞数/ ml。
3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中,并另加入1 ml 含不同浓度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM,使血清最终浓度为10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。
4. 37 oC,5 % CO2 培养箱培养5-7 天,期间不需更换培养基,待细胞群落大到可以肉眼观察,而群落间不互相接触即可。
5. 去除培养基,加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1),室温下静置10 min。
6. 去除固定液,水洗二次。
7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution,,室温下静置染色2-3 min。
8. 去除染液,水洗二次。
9. 以肉眼计数群落数
10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency ):
SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency):
SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
比较各浓度血清培养基之RPE,即可得知待测血清对细胞生长的影响。订购多量同一批号的优良血清,置于–70℃ 保存之
在《细胞培养中的细节问题〉看到的,希望对大家有用