小中大注意事项:
(1)选择适当得细胞接种浓度。
(2)避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
(3)设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。
MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系,
IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!
举个例子:各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0.1,抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。代入
计算公式:
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
有一个公式可供参考;
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率
Pn:最小阳性反应率
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值
公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率
例:
用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值。
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一般要低于IC50,避免非调亡性杀伤的细胞太多,造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50,作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%,用药后一般为5-10%(Annexin V),细胞周期的亚G0峰比较明显.