[求助]腺病毒转染293细胞问题？ - 经验共享

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标题:[求助]腺病毒转染293细胞问题？

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也郁闷啊！！用自己扩增、纯化出来的病毒做转染也没有出现跟以前一样的结果啊！！和最近几次的结果相似。难道自己纯化出来的病毒也失活了？有谁知道这又是啥原因啊！

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你说的污染是啥东西污染呢？？
我培养基未见混浊啊，未加病毒的293 细胞长得还听好的？可是一加病毒就变成图片里的这样了
但是培养基还好的未见混浊？？

附件

2012-5-30 12:24

53661355.snap.jpg (55.46 KB)

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得你这个是病毒量少而不是多的缘故，污染可以排除。在这之前你做过两次，两次结果都可见完全CPE，一次是4天收获，一次为6天收获。可否将你收获时的图发上来看看？假如是完全病变收获时间合适的话我建议继续富集，而不是扩增。

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这张照片就是我最初两次做成功的，开始收获的时候的照片，细胞已经CPE 了都浮起了，所以就开始收获，收获后过了一段时间我将两批扩增的病毒，一起按照TAKRA纯化试剂盒和滴度鉴定试剂盒来纯化和鉴定病毒滴度的。鉴定结果病毒滴度为1.5-12.0×109 ifu/ml ，最近我就用这个滴度的腺病毒100ul，加到100ml的含2％FBS的DMEM培养基中混匀，后20ml/瓶分装到5个175cm2的瓶中，去进行转染293细胞的。可是最近就是得不到完全CPE 细胞就死亡了，做了几次都是类似的结果。望everlisa 以及各位高手多多指点！！！
一直等待中...................

附件

2012-5-30 12:25

75564395.snap.jpg (50.68 KB)

tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

RE::"不同的腺病毒收获时间不同的，pAdEasy系统就是10天"
10天应该是第一次转染收获的时间吧，等到出现明显病变再进行大量扩增时收获的时间是一样的。

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我这个前两次收获的时间为4天和6天！
可最近一过三天细胞就死了阿？

wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在不是将多少量的病毒加到175CM2瓶中，而是继续富集。所谓富集就是75CM2收获的病毒象你说的四天或着六天收获，那你就将收获的病毒经裂解后再全部加到75CM2瓶中，最好细胞长到70~80%状态好的时候接毒。假如这样做下去直到细胞完全病变时间控制在24~36H小时，那是你再考虑将病毒1比几扩增。凭以往的经验293细胞的状态很重要，一定要代次低的生长状态好的才能接毒，否则只是在浪费你的病毒而已。病毒富集是个慢工，急不来的，祝顺利

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

所谓富集就是75CM2收获的病毒象你说的四天或着六天收获，那你就将收获的病毒经裂解后再全部加到75CM2瓶中?? 这里裂解后得到的病毒,需要纯化过? 还是用离心方法将细胞碎片去除后,用上清液直接去转染下面一批细胞?

jujuba[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.细胞病变完全的时候收集细胞1000rpm*8min，去上清。
2.加适量细胞裂解液，混匀
3.-80度~37度冻融三次（至少间隔３０ＭＩＮ）
4.4000RPM＊３０ＭＩＮ收获裂解上清
５.用收获的上清直接感染细胞
直到细胞在３６Ｈ小时左右病变，接下来就进行病毒扩增就可以了
富集不需要纯化（纯化会损失病毒）

大白菜[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位老师:我用pad tracke-cmv 和adeasy-1系统重组腺病毒，重组后的腺病毒ad-目的基因经过PAC I 酶切用脂质体转染细胞，包装重组体腺病毒，在转染前，我对Pac I酶切ad-目的基因证明是正确的（一条为30KB,一条为4.5KB），可是我转染过程中，每次在24h观察转染效率很高，即有很多绿色荧光表达，但是随着时间的推移，荧光越练越少，细胞也没出现细胞病变现象，到12d－14天准备收毒时，已经没有荧光了，我曾想到是没有对PAC I 酶后的ad-目的基因纯化，但是仍然不能避免。一位老师说有可能是padtrack-cmv上一个表达信号出了问题，建议我重新用另一实验室的padtrack-cnv和ADEASY-1同源重组, 请问大侠们，我的问题出在那里？为什么只能瞬时表达，而不能稳定表达？？我需要重做么？是我收毒晚么？但是没有细胞病变啊！感激涕零多谢指教！◎

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