小中大回复 #25 zranqi_1 的帖子
首先说明一点，养细胞是很难的，用100%的努力，也许只能得到1%的结果。建议你先把一些该注意的东西联系好，最好有一个人能带你做，预实验一定要严格的做。很多东西不是1+1+1的结果，
(1) 试剂： 细胞培养基RPMI-1640,优等胎牛血清， PBS,细胞因子：rGM-CSF、rIL-4、tnf、rIL-10。
(2) 设备：1%明胶包板的6孔板 相差显微镜 荧光显微镜 ，FCM
1．取健康wistar大鼠骨髓: 断颈处死小鼠,置75%乙醇浸泡5min,无菌取出股骨,置75%乙醇浸泡3-5min,PBS冲洗，无菌操作下剪开股骨两端,注射针头插入骨髓腔, PBS液冲洗骨髓至苍白。（冲洗多少ml?）收集（多少ml 冲洗液？）骨髓细胞，PBS重悬骨髓细胞，1000rpm/min离心5-10分钟，倾去上清再离心，（这一步是为了收集）共3遍 ，收集沉淀的骨髓细胞。(分离时用淋巴细胞分离液吗？两种方法，都可以，用的话分离的更纯)
2.含10%Fcs的完全RPMI1640重悬细胞并调整细胞数至1-2×106ml,用含GM-CSF(50ng/ml)IL-4(10ng/ml)的RPMI1640培养基调整细胞浓度至1×106/ml,置于1%明胶包板的6孔板中培养, 隔2日半量换液，吸去部分上清再加入GM-CSF(50ng/ml)IL-4(10ng/ml)的RPMI1640培养基。
3．培养至第5天,收集疏松贴壁的增殖性细胞聚集体,（无菌NS冲洗，收集DC前体细胞，）一组继续在GM-CSF(50ng/ml)IL-4(10ng/ml)的RPMI1640培养基，培养作为对照(tnf组);另一组在原培养基中加入浓度10ug/L（常用il-10浓度0.2 ug/mL）IL-10(IL-10组);培养至第10-13天,收集细胞(imDC),用于后继实验。 4．并观察细胞生长状况和形态,每次旧液经离心后收集细胞继续培养,上清留用(和1640混匀后加回孔板内).
DC的形态学观察 用滴管收集培养获得的悬浮生长的细胞于离心管中,调节细胞密度至5×105/ml常规制作扫描电镜标本,观察并摄片。
4.用台盼蓝拒染法测定细胞活力
DC的鉴定：
1.DC形态学的检测：分别用倒置相差显微镜和电镜观察细胞形态(在那做电镜，问那的老师)
2.免疫荧光法观察细胞形态
3.FCM检测imDC和DC的表面标志
4.MLR
