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标题:[讨论帖]神经干细胞、神经元培养互助小组

tudou85[使用道具]
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发表于 2012-6-8 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教各位高手:神经元的原代培养一定要加神经生长因子吗?价钱是不是很贵?
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33号[使用道具]
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发表于 2012-6-8 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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过完“五一”要进实验室了，可还是一头雾水，看了鄂征老师主编的《组织培养技术及在医学中的应用》，说新手要把每个步骤都程序化，列出来，按步骤做。有那为前辈这样作过吗？能介绍以下吗？
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langlang[使用道具]
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发表于 2012-6-8 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我从文献上看到有人培养成年（>2weeks）大鼠，用木瓜蛋白酶消化，吹打，然后用密度梯度离心分离神经元。就是不知道这里有人做过吗？
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发表于 2012-6-8 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同志们辛苦了，我喜欢在做实验的时候发现一些操作上的窍门，创新一些心得！希望交流！提出一个问题，大家用原代的细胞悬液过筛网a.用不锈钢的好还是尼龙的好？讨论一下．因为不锈钢的好高压消毒，但是会扎手，而且怎么自己去制作一个过筛的装置呢？是象筛面一样吗？尼龙的软，效果不知怎样？谁实验过？可以象传说中的包起组织在外面挫洗吗？另外我知道光筛网的材质就有十几种？同一种价格相差可达到１００多元？有什么要求吗？大家不要看不起我的问题，其实我们的实验光想者用进口的试剂，谁考虑过你的试管＼烧杯＼筛网＼量筒＼都合格吗？合格你的操作方法是否正确？实验的结果可能最终就是因为这些小的问题而失败＼无法解释．有人同意吗？随便讲！
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发表于 2012-6-8 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下，做完单细胞悬液后马上用于，并不接着用于细胞培养，那在制备单细胞悬液过程中，是否也要象原代细胞培养那样要求无菌原则呢？请各位大侠不吝赐教，多谢了

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朋友，不用无菌，因为你去检测检测钙离子或细胞凋亡无非是用共聚焦＼或流式，最终细胞都会死亡的，没有必要无菌，但是你还专门有＂污染＂的操作地点来处理组织吗？
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乌贼老弟[使用道具]
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 小中大
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过完“五一”要进实验室了，可还是一头雾水，看了鄂征老师主编的《组织培养技术及在医学中的应用》，说新手要把每个步骤都程序化，列出来，按步骤做。有那为前辈这样作过吗？能介绍以下吗？

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娃，别瓜了．还写步骤，你泡到实验室后就自然练出来了，写那些没有用，只会增加负担，还很难实施
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xevin[使用道具]
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发表于 2012-6-8 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好！我一直在做大鼠纹状体神经元的原代培养，方法很稳定了。但是，我现在遇到很大的难题，就是发现转染(Lipofectamine 2000 和CaPO4都试过）原代神经元，转染率实在太低了，有那位战友有这方面的经验，请告诉我！谢谢！
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发表于 2012-6-8 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是做神经干细胞的，现在还在为配置培养液而发愁，因为网上的配方太多太杂，最关键的是我还没有money，因此想求教你看你的培养液里加了些什么？我只有1640、DMEM、四季清FBS、双抗、你说能长出神经球嘛？BFGF、NG、EGF、等等等是不必须的？谢谢！不必需的我就不浪费钱了。时间长、长的慢没有关系、关键是要少走弯路、别浪费试剂。再次致谢！！
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 小中大
对于楼主的提议强烈支持！希望在这里我们能够找到帮助！
把我的神经元培养方法给出，供大家参考！这是多次摸索总结的一套十分成熟的方法，如那位实验不顺，不妨一试！

海马、皮层神经元的原代培养
取新生一天的Sprague-Dawley 大鼠，浸泡于75％酒精中消毒，断头后于4oC解剖液中剥离海马，并用显微镊仔细去除血管、脑膜及非海马的其他组织，然后用虹膜剪剪碎组织，将解剖液吸出，加入1~2ml胰蛋白酶溶液（0.125%含EDTA<吸附Ca离子Mg离子，有助于细胞分离，但对细胞毒性小>）于37 oC消化15min左右（中间翻动1～2次，以观察消化情况，组织抱团且组织块间拉丝即可终止），加入全培液（80%DMEM+10%胎牛血清+10%马血清），10min，终止胰酶作用。移去溶液加入全培液2ml，吸管轻轻吹打10~20次，（不要超过20次）使细胞团分散。自然沉淀10min，（离心对细胞有损伤，自然沉淀就很好）吸取上清液用全培液制成细胞悬液（2×105/ml），接种于预先涂有poly-L-lysine的培养液中，置37 oC，5%CO2孵育箱内孵育培养。24h后用B27培养液换一半，继续培养，以后每三天换液一次，每次用B27培养液换一半。
皮层分离方法同海马，只是消化时间为10min左右。
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leifengta[使用道具]
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发表于 2012-6-8 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外深感实验试剂的准备很烦，把我的相关信息列出，希望能减轻同仁的烦恼！
1 培养液：DMEM(新手最好买配好的液体，干粉配制麻烦，且易污染)；胎牛血清（一定要进口的,1300RMB）；马血清（进口国产无所谓）；B27/Nearobasal培养液（只有GIBCO有，买现成的，1200RMB）。
2 消化液：0.25％胰蛋白酶（含EDTA,100RMB）(使用时稀释一倍！)
3 解剖液：DISGH(自配)
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