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标题:[讨论帖]神经干细胞、神经元培养互助小组

any333[使用道具]
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楼上的真是个好人!谢谢了!
我打算养海马神经元,下星期正式进实验室了。之前在别处参观了一个月,心里有点底了,但是不知到自己做会怎样?
我说说那个老师的方法吧
他是用E18的胎鼠,解剖镜下,DHANKS液中取材,一定要把膜跟血管去掉,至于连着一点皮质倒不要紧。消化用0。125%的胰酶和EDTA混合液,10分钟,室温下。加入全培液DMEM/F12(进口)+15%胎牛血清(国产)终止酶作用,清洗3次,细吸管吹打15次左右,200目滤网过滤,离心1000Z 10分钟,加入DMEM/F12+2%B27吹打,记数,接种。24h后用B27培养液换一半,以后每四天换液一次。第八天加药。
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爱老虎游tt[使用道具]
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大家的初衷都一样,都想能省则省,生化试剂又着实很贵!但我的经验是,应该大处着眼!神经细胞比较难养,条件苛刻,培养过程中许多因素会导致实验失败,所以,我们要把失败率尽量降至最低!实验的成功才最重要!否则,无论时间,还是金钱,都是最大的浪费!
不知你具体指什么培养液?
我实验中培养神经元的全培液是80%DMEM+10%胎牛血清+10%马血清,
DMEM( PH7.2)
DMEM 1包(干粉 10×1L 300¥)
葡萄糖 1.5g
L-谷氨酰胺 0.3g(如配置液体存放超过2周要补加同量的 L -谷氨酰胺)
HEPES 5.9578g(25g 151¥)
NaHCO3 3.7g
胎牛血清(100ml GIBCO 1300¥)
(一定要进口的,否则事倍功半!)
马血清(无所谓进口国产,GIBCO 100ml 176¥)
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dragonkilly[使用道具]
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同志们辛苦了,我喜欢在做实验的时候发现一些操作上的窍门,创新一些心得!希望交流!提出一个问题,大家用原代的细胞悬液过筛网a.用不锈钢的好还是尼龙的好?讨论一下.因为不锈钢的好高压消毒,但是会扎手,而且怎么自己去制作一个过筛的装置呢?是象筛面一样吗?尼龙的软,效果不知怎样?谁实验过?可以象传说中的包起组织在外面挫洗吗?另外我知道光筛网的材质就有十几种?同一种价格相差可达到100多元?有什么要求吗?大家不要看不起我的问题,其实我们的实验光想者用进口的试剂,谁考虑过你的试管\烧杯\筛网\量筒\都合格吗?合格你的操作方法是否正确?实验的结果可能最终就是因为这些小的问题而失败\无法解释.有人同意吗?随便讲!

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我们师哥自制的筛网,用起来还比较方便,你可试试:用一次性注射器,拔去芯,切去注射筒的下半部,将筛网剪的比下边圆口稍大,在酒精灯上稍稍加热注射筒下口,使塑料口熔化,迅速压在筛网上,就好。可以高压消毒,用时细胞悬液从上口加入即可。
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乌贼老弟[使用道具]
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同志们辛苦了,我喜欢在做实验的时候发现一些操作上的窍门,创新一些心得!希望交流!提出一个问题,大家用原代的细胞悬液过筛网a.用不锈钢的好还是尼龙的好?讨论一下.因为不锈钢的好高压消毒,但是会扎手,而且怎么自己去制作一个过筛的装置呢?是象筛面一样吗?尼龙的软,效果不知怎样?谁实验过?可以象传说中的包起组织在外面挫洗吗?另外我知道光筛网的材质就有十几种?同一种价格相差可达到100多元?有什么要求吗?大家不要看不起我的问题,其实我们的实验光想者用进口的试剂,谁考虑过你的试管\烧杯\筛网\量筒\都合格吗?合格你的操作方法是否正确?实验的结果可能最终就是因为这些小的问题而失败\无法解释.有人同意吗?随便讲!

我们师哥自制的筛网,用起来还比较方便,你可试试:用一次性注射器,拔去芯,切去注射筒的下半部,将筛网剪的比下边圆口稍大,在酒精灯上稍稍加热注射筒下口,使塑料口熔化,迅速压在筛网上,就好。可以高压消毒,用时细胞悬液从上口加入即可。

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高,实在是高!!!震撼啊!!真是强中自有强中手,一山还有一山高。我今天又做了一次原代,还是过滤时的麻烦!!镜下很多杂质,是我强行正压造成的。不知到大家有没有遇到过细胞悬液过200目筛网时漏不下去,都悬在筛网上,妈的好象是一块钢板,液体就在筛网上乱流。同仁们,大家谁有好办法啊!!!难道非要正压过滤,把不想过的都漏了过来??还是要用不同型号的筛网分别过滤?如(100、200、400、600目不等?)请请请。。。。。。
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glass[使用道具]
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液体在筛网上不容易漏下去,大概有表面张力的原因,把带着液体的筛网在培养基里蘸一下,液体就容易漏下去了,试试看。
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乌贼老弟[使用道具]
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我在做海马神经元凋亡,想请教你们怎么把海马组织制成单细胞的?

我是做纹状体NSCS培养的,也需要制备单细胞悬液,我想虽然我们的目标细胞不同但制备细胞悬液的目的是相同的,所以将我的方法介绍如下,望批评指正、相互交流。
1、取材后将组织块置于小烧杯或离心管中,加入培养基用普通火焰剖光的滴管吹打20次左右,此时培养基会因有大量细胞悬浮而变得浑浊。
2、静置细胞悬液1分钟,使未吹散的组织块沉入容器底部,小心吸取上部细胞悬液,尽量不要吸出组织块。
3、再用自己特殊剖光的滴管吹打10次左右,注意剖光后管口直径大约1~2mm,这样可以使细胞最大限度地形成悬液,又不至于过度损伤细胞。

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我是做nsc的,听说过纹状体内有干细胞,不知你做的怎么样?好养吗?取材怎么取的?方便把资料共享一下吗?到底应该取哪个部位?哪个部位好一些?
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广大同人,有周末还泡实验室的吧,辛苦了啊!在此小弟扔出一砖:在解剖分离、剥离乳鼠的脑膜、血管时你们都很轻松吗?大家都是神经外科的爷们吗?我发现鼠的大脑总共才三分之一个小指肚大,放在d-hanks液里还跟豆腐脑似的,吐露吐露的,又没有固定,怎么剥离出干净完整的海马、纹状体、vz、svz区啊?文献上都说的简单的和一似的,你们都有用解剖显微镜吗?好象不太可能。
在此造次一下:估计大家都是肉眼估计着剥的把。谁有更好的实用的方法,拿出来交流一下。反正我是觉的这是一个问题。难道每个实验室的细胞培养都还配置了解剖显微镜?大家都是神外的一刀客吗?请随便发言!
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fei1226com[使用道具]
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广大同人,有周末还泡实验室的吧,辛苦了啊!在此小弟扔出一砖:在解剖分离、剥离乳鼠的脑膜、血管时你们都很轻松吗?大家都是神经外科的爷们吗?我发现鼠的大脑总共才三分之一个小指肚大,放在d-hanks液里还跟豆腐脑似的,吐露吐露的,又没有固定,怎么剥离出干净完整的海马、纹状体、vz、svz区啊?文献上都说的简单的和一似的,你们都有用解剖显微镜吗?好象不太可能。
在此造次一下:估计大家都是肉眼估计着剥的把。谁有更好的实用的方法,拿出来交流一下。反正我是觉的这是一个问题。难道每个实验室的细胞培养都还配置了解剖显微镜?大家都是神外的一刀客吗?请随便发言!!!

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解剖显微镜的确要比放大镜和肉眼好用,我今天才刚刚借到一台。剥膜时稍用点D-hanks液,组织就不会太滑。
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zwsyrt[使用道具]
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事情是这个样子的:

根据你的要求采用不同鼠龄的大鼠,如果是培养皮层或海马神经元,可以用18天的胎鼠;要是做急性分离,用出生后的大鼠5-15天均可。估计你是要做培养,胎鼠的大脑太小,分离大脑皮层时尚可靠肉眼分辨,但如分海马,还是用解剖镜为宜。事实证明,解剖镜还是可行的,只不过刚开始要熟悉一下镜下操作。
最后,祝顺利!
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zwsyrt[使用道具]
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对了,差点忘了说,我们实验室在做海马分离时,盛有DMEM的平皿内放置了一张滤纸,将鼠脑放在滤纸上面,分离时就不会滑动了。别忘了滤纸也要事先消毒。so long
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