小中大呵呵，其实大家有一个问题一直没有搞明白……什么情况下荧光会降低？
以Rh123为例：
做流式的时候，你用 “过量” 的Rh123孵育细胞，直至细胞内线粒体的Rh123吸收达到最大。这个时候显然线粒体膜电位越高，能够吸收的Rh123越多，，也就是进入细胞的Rh123总量越多，流式检测到的Rh123信号越强。这个过程大家应该很容易理解。
在另外一种情况下，Rh123的总量是 “恒定” 的，比如说测定线粒体的膜电位。将一定浓度的Rh123和的线粒体共孵育一段时间后，在荧光分光光度计下可以得到一个稳定的读数（比如说100），这个时候线粒体内外的Rh123达到平衡（比如说内：外＝80:20）。如果我给予线粒体的底物（如NADH）激活线粒体呼吸链，这个时候线粒体膜电位将会升高。结果更多的Rh213进入线粒体内部（比如说内：外＝90:10）。
那么问题来了。从化学的角度来说，如果某个荧光物质的激发光谱和发射光谱有一部分是重合的话（这种情况很常见），其发射光有一部分（与激发光重合的部分）会被自己重新吸收，而且这种吸收的效益随着该荧光物质的浓度增加而增强。这就是所谓的“荧光淬灭"。换而言之，当荧光物质浓度很高的时候其荧光强度和浓度的增加不成正比，而是有点“跟不上”了。
这样我们就好理解了，当线粒体内外的Rh123达到90:10的时候，虽然总量不变，但是进入线粒体内部的Rh123发光的效率会下降，此时的荧光强度将会低于100（比如说98？呵呵）。而无论是共聚焦还是流式，虽然也有荧光淬灭的情况出现，但由于线粒体或者细胞当中总的Rh123的量还是增加的，所以测得的荧光都是增加的。
附上“LED专用红色荧光粉的激发光谱和发射光谱对比”，希望有助于大家理解。
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请问为什么我看到的RH123都在线粒体上呢？难道是我染的Rh123浓度不够吗？而且随着细胞的凋亡，我并没有看到Rh123的亮度的下降或者荧光弥散到细胞质中，请问这又是什么原因呢？望知道的战友赐教，谢谢！
