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标题:[求助]G418筛选预实验

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发表于 2012-6-21 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的质粒上没有荧光标记,要等到筛选完了以后打动物的,那要怎么办呢?
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2012-6-21 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以用免疫细胞化学检测！
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3648755[使用道具]
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发表于 2012-6-21 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做G418筛选预实验时每个浓度是不是要多弄几个孔?还是一个孔就行了?急盼高手指点!多谢!多谢!
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3648755[使用道具]
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发表于 2012-6-21 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
筛选的培养液是不是要用没有双抗的?还有做稳定转染时必须要用DMEM的培养基吗?
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发表于 2012-6-21 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用什么培养基视你培养的细胞特性而定吧 不见得非用DMEM
一般设三个复孔就足以 各浓度3复孔，设正常对照3复孔。
以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2012-6-21 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选
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发表于 2012-6-21 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也需要做筛选,在贵宝地受益非浅,有些疑问,借贵宝地一用!
我待筛选的细胞是悬浮细胞,如果每三天换一次含G418的培养基,每次都要离心,持续2周,而且是用24板养,细胞不是很容易被污染吗?
希望高手指点一下!非常感谢!
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发表于 2012-6-21 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也想请教下作筛选预实验时，比如24孔板每孔应该铺板多少细胞，而且G418何时加入呢，因为看了些文献，G418并不是杀细胞剂，只是抑制蛋白质合成，阻止细胞分裂，所以比较困惑这个细胞密度和加药时机的问题
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3648755[使用道具]
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发表于 2012-6-21 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我以前在看的是每孔1000个细胞,因为要给细胞足够的生长空间,但是什么时候加药就不太清楚了,希望高手指点啊!
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发表于 2012-6-21 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

每种细胞的生长状态和速度不同，在一些细节处理上可能也不同.我的是这样做的：

1、G418筛选实验：
转染293细胞，生长较快，所以在96孔板中加入100ul细胞（2000／ml)，第二天就加入G418,从0,100,200。。。1000ug/ml，复3孔。每天观察。
前几天，低浓度的孔中细胞生长，中浓度的细胞生长缓慢，高尝浓度的不长，稀稀拉拉。约一周左右，中浓度的孔中出现死细胞，低浓度的死细胞较少，未加G418的孔长得很密。 14天时，观察细胞全部死亡的最低浓度孔，在500ug/ml，做稳定转染时选用的600ug/ml。

2、稳定转染
24孔板，细胞密度也较小，转染后第二天1：10稀释传代，设立空白细胞对照组，第三天加G418（600ug/ml)。耐心等待2周，前一周细胞死亡较少，后一周死细胞较多，可3天换液，待对照组里的细胞全部死亡，就可以开始挑单克隆了。
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