液相色谱

在做一个样品HPLC条件的优化时,遇到个问题向大家请教下

用的HPLC-ELSD-UV.上次做的时候,其中各个成分分离度良好
今天作的时候,分离度就不行了,原来分开的三个峰现在都堆叠在一起了.仪器和仪器方法都没有变,同一个梯度洗脱,样品也是同一个样品,柱子也是同一个柱子

为什么就重现不出来了呢?可能有哪些原因呢?有知道的高手解释下,小弟在这谢过了!!

可能的原因：1.柱没平衡好：检查峰的保留位置是不是有较大变化。
            2.柱已在某种程度上被损坏导致柱效降低：检查保留时间、理论塔板数、柱压值是否都有较大改变。
如果以上情况都没有，不会是样品的问题？

柱效下降了，再生色谱柱试试！

样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低 。

使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)

柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，柱外死体积要小

如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。这种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。

还有一种可能是柱温的问题.温度不稳定会影响溶剂（甲醇，乙腈）的溶解度。通常温度低组分保留时间增长，对于大都数性质稳定的组分来说，冬天与夏天分析同一样品，温度的影响会改变出峰的时间，峰形稍有所变，另分离度可能会受一些影响，但影响程度不至于不能重复分离条件.

先看看柱效，如果没问题的话，流动相如果不合格也会影响分离的，你也可以降低浓度试试

上一次做完HPLC后柱子没冲好也会影响下一次的分离。

好好回忆一下上次做的的条件，这种情况很少见的，。肯定是条件有变化了，尤其是洗脱时间程序，和开机后冲洗条件，