[分享帖]用FN包被培养板的方案，自己摸索的体会

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标题:[分享帖]用FN包被培养板的方案，自己摸索的体会

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发表于 2012-7-18 09:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有关细胞技术的热门话题——用FN包被培养板的方案

因为课题需要，我要养人外周血来源内皮细胞，得先用human fibronectin包被培养板。但是昨晚我看了个通宵，把园子里关于FN包被培养板的帖子大致浏览了一遍，反而越看越糊涂了——几乎就是百家争鸣的局面：
从稀释融解开始，有人说不能用三蒸水，要用制药用的纯水，否则PH值不对会影响活力；有人说用PBS，有人说用加了尿素的PBS；母液的浓度一般说是1mg/ml，但是买来的FN一般就是1mg，按这个浓度配置母液只能得到1ml，这么小的量如何分装啊？
至于包被的浓度，差异更是很大，有人说各个公司的产品不一样，还是以说明书上说的为准，是不是这样啊？
另外，包被的方法，有4度过夜的，有37度过夜的，有37度2至3个小时的，还有四度过夜或37度2至3个小时的……
晕了，彻底晕了……
我买的是ROCHE的1mg装human fibronectin，用的是corning的24孔板，最后对各种方案进行了摸索，结果见下面的帖子。

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发表于 2012-7-18 09:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以按照ROCHE说明书上的操作。我们的经验是双蒸水、无菌的PBS就可以了，100ul的双蒸水溶解后再加900ul的无菌PBS，配好1MG/ML的母液，根据包被时的终浓度是5ug/cm2，再用无菌PBS稀释到50ug/ml，也就是将母液稀释20倍，20ml按实验需要分装，－20度保存。包被时候按100ul/cm2加，在室温或37度放30－40分钟都没关系。

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发表于 2012-7-18 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢楼上的指点！
您的意思我是这样理解的：
1、先加100微升双蒸水（用三蒸水不好吗？）
2、再加900微升PBS，静置溶解
3、溶解后加PBS至20ml，按实验需要分装
以上操作皆在室温下完成
4、使用时，24孔板每孔加200微升，37度放置30至40分钟
然后就可接种细胞
不知我理解的对不对？

这里有个疑问，包被的时间30至40分钟够不够？延长一些会不会有好处些？因为见很多人都是过夜的。

还望再次赐教，不胜感激！

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发表于 2012-7-18 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

刚刚又再看了一下浓度的问题，大致归结为以下三种方案：
1、论坛里大部分群友用的还是50微克/毫升的浓度，室温或37度下放置30至40分钟。
2、我请教了有的人用的是10微克/毫升，4度过夜。
3、还有我见一篇文献《成人外周血内皮祖细胞分离和诱导分化》中南大学学报(医学版)J Cent South Univ (M ed Sci) 　2005, 30 (5)上面写的是1微克/毫升，37度过夜。

至此产生一个疑问：是不是这几种方案都可行？浓度越高的，需要的温度就越低，时间就越短，而最后达到的效果是一样的？
如果真是这样，那么以上3个方案是一个比一个便宜啊，那我干脆用第3方案得了？第1方案比第3方案贵了五十倍啊！比第2方案也贵了五倍。
非得花那么多钱吗？FN不便宜啊！
还请指点！
不胜感激！

[ 本帖最后由 33号于 2012-7-19 11:44 编辑 ]

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发表于 2012-7-19 11:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最后用了50ug/ml，4度过夜的方案，同时也试验了10ug/ml，看最后结果如何。
但是今天似乎有一步做错了，现在还很担心：接种细胞悬液前，吸出培养板里的FN以后，我用培养基洗了一下培养板——不知是不是不该这样操作？这样会不会使蛋白丢失？
哪位高人出来发表一下意见?前辈们都是怎么做的？

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发表于 2012-7-19 11:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我刚买来SANTA的FN,说明书上是这样写的:用PH7-9的无血清不含钙和镁的培养液或缓冲液稀释.包被后室温孵育1小时,吸出剩余液体后用dH2o清洗.这样包被的板必须马上使用或者2-8度无菌保存,我没有无菌冷藏的条件,是不是只能按说明书的方法将其重构以后分装冷冻保存呢?
还有,我看文献里写随着FN浓度增加,其促进细胞增殖黏附的效果增强,我想选5,10,20,40ug/ml四种浓度,1MG的FN应该怎么稀释好呢?

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发表于 2012-7-19 11:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

按说明书上说的液体溶解，建议1mg溶在1ml液体中，便于计算和分装。可以根据自己每次需要的量，先把1ml（此时浓度为1mg/ml）的母液分装为100ul左右一支，然后用的时候拿出来稀释。如果你同时试验这些浓度的话可以先把母液稀释到你所需的最浓的浓度，然后从中取出一部分稀释为次浓的，以此类推，得到你你所需的所有浓度的FN。
另外，FN其实我都回收利用的，感觉效果也差不了太多，没办法，穷啊，呵呵！

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发表于 2012-7-19 11:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我先稀释到50ul/ml然后分装冻存的,现用现稀释到我要的浓度.
我按说明书上写的,室温包被1小时,然后吸上清,BSA封闭,做出来的结果不太好,没出来我想要的梯度效果.
FN怎么回收啊,我每次用完都扔了,虽然觉得可惜,但没办法...

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发表于 2012-7-19 11:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这么多方案，真是晕。我刚得到一个方案是同学摸索好的：20ng/ml浓度，PBS配置。看来这个方案最省钱啊。

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-7-19 11:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

忘记说时间了，是20ng/ml，PBS配制，4度过夜。还可重复使用。

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