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标题:[分享帖]总结的MTT方法原理

zranqi_1[使用道具]
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另外96孔板可以重复利用,可以用11次,先用高压水龙头冲,然后超声波洗,洗完后烘干,再去酒精浸泡10小时,就可以了!千万别划破啊!
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yysr238[使用道具]
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我听说做悬浮细胞的时候要用到96孔板离心机,如果直接吸的话会把细胞吸出来的,上清不吸出的话,旧的培养基会不会影响到细胞的生长?
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milkdog[使用道具]
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用MTT检测法测定CMC

1. Fen细胞培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中,在25cm2培养瓶中生长到接近汇合。用含0.05%胰蛋白酶,0.02% EDTA的PBS消化细胞5分钟,洗涤后,用细胞培养液将细胞配成1×105/ml。

2. 取96孔细胞培养板,每孔加0.1ml细胞悬液,在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培 养箱中培养24小时,让细胞帖壁。每孔加0.1ml效应细胞悬液,效靶比10:1到50:1,继续培养4小时,让效应细胞发挥杀伤效应。实验中,设立只有靶细胞的无杀伤对照和只有 效应细胞的阴性对照,每种处理设3各复孔。

3. 用含2%小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤各孔 3次,洗去不粘附的细胞。每孔加 0.1ml含2%小牛血清的RPMI-1640培养液和10μl 5mg/ml的MTT染液,继续培养3小时。

4. 用PBS洗涤2次,每孔加0.1ml含0.04mol/L HCl的异丙醇,室温30分钟,溶解形成的结晶。在570nm波长处,用酶联检测仪检测各孔的光吸收值(OD)。

杀伤活性(%)=(OD实验孔-OD阴性对照) /OD无杀伤对照× 100

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在加DMSO前可以加PBS洗吗?我做过几次,这样就会把晶体洗掉一部分啊?
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bananapeople[使用道具]
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在加MTT前是直接在原来的培养液里加,还是需要把培养液吸出来在加用培养液稀释的的MTT呀?还有这里的培养液要求是有血清的还是没有血清的啊?请求赐教啊!谢谢拉!
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ROSE李[使用道具]
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我做的是悬浮细胞的MTT结果较理想。
MTT是用PBS配的,用时直接加20ul入孔中。反应4小时后,一孔一孔吸到ep管中离心。离心后去上清,再加入dmso吹打后加入原孔中。这样甲臜也基本溶解了。5分钟可上机检测。
我曾经用过直接整个板子一起离心(专门的孔板离心机),虽然很省事,可是结果不太好。只好一孔一孔离心。
96孔板的重复使用
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zhenxin[使用道具]
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MTT太不稳定了,我都快被烦死了。
直接拿96孔板作,有时候结果很好,有时候结果也是莫名其妙。我的重复孔都设到16个了。同一批MTT溶液,结果好的一些也不是最开始用的时候,肯定和MTT溶液没关系。细胞也是用的同一细胞系,浓度都是差不多。试剂也都是分装的,每次用一个分装。
我曾经拿6孔板实验过,培养好的细胞中1ml加MTT溶液100ul,4小时后很明显在阴性对照组,试验组,阳性对照中的深色颗粒有很大区别,有很明显的区别,应阴性对照组最多,最密;实验组明显中间,比较稀疏;阳性对照组很少,最稀疏。接着用DMSO溶解,颜色深浅也是有区别的,但是试验组的颜色带红。
然后收集每组的上清分配到96孔板中,再测量。
结果颜色浓度在中间的实验组数值却是最大。我用450和550 来测结果都差不多,没多大区别。
有时候做得时候加了MTT过了4小时每孔皆墨,什么对照都没区别。

有哪位高手能解释下原因吗?
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社会主义好[使用道具]
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我的一点体会:
1、接种细胞一定要均一,可以把细胞混悬液倒在96孔板盖上,用排枪加。
2、加任何液体都要轻(最好贴壁加),不要把细胞冲起来。
3、最后上酶标仪测时要快(同一块板,前后测两次数值都不同)。
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hyuu[使用道具]
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我也试过把细胞分成阴性对照阳性对照实验组几部分,先分别放在试管里稀释好,分别加上试剂,再搅拌均匀,然后再分到96孔板里。效果仍然是时好时坏。
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