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标题:[求助]NB4细胞先成团,再大量死亡.

wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-7-20 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
3000转？好高啊。
我只用1000转5分钟，甚至800转。
“再用0.7毫升培养液洗一次”是什么意思？不明白。。。。。。
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xue258[使用道具]
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发表于 2012-7-20 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

...........
3000转很高蛮??“再用0.7毫升培养液洗一次”就是说离心后弃上清.加入0.7毫升培养液,再次离心后加入“再用0.7毫升培养液洗一次”培养瓶中.之前的师兄建议这样的,他以前也养的NB4.
今天看细胞,又有很多死亡的碎片了....
哎,真是不容易啊.实验室已经快没有冻存的细胞株了.再出问题的话就郁闷了.
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-7-20 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

3000转太高了。刚复苏的细胞很脆弱的。甚至有些书上说离心对复苏的细胞比DMSO对复苏的细胞伤害还要大。建议复苏第2天再离心去掉DMSO。
因为我养的HL60对DMSO敏感，所以每次都是立即离心，1000转/分，5分钟。24小时后再换一次液去掉死亡的细胞。不要担心1000转浪费细胞，你3000转确实太高了。只要有活的细胞，肿瘤性质的，条件适合，总会长起来的。
你冻存的细胞是同一批的吗？是不是冻存的时候状态本来就不好了？试一下用别人的培养基，加大血清浓度。20％看看。
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xue258[使用道具]
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发表于 2012-7-20 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好的，谢谢wu老师。
再总结一下。
肿瘤都养成这种确实有点郁闷。呵呵，不过也学到很多东西就是了。
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xue258[使用道具]
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发表于 2012-7-20 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天有师姐说，离心的话一般EP管用3000转，而10毫升的离心管的话只能用1000转。自己分析的话是不是因为离心时候的半径不同，所以离心力才有不同，以至于转数差别这么大呢？以前都想是10毫升的液体多些，应该用转数大的。做之前确实不知道原来有这么多细节的问题需要注意。从小小的一个细胞复苏都学到了不少东西。
今天看细胞，又很凄凉了，都快成复苏专业户了。
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发表于 2012-7-20 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主:
我最殘的经历是复苏了六次,一次也没成功.总结一下经验供楼主参考.
1化冻要非常快!一般用四十度化冻.冻存管浸到水里也不要紧,仔细操作不会染菌..
2是转速要低,不可以超过一千,因为细胞太脆弱.化冻后可以直接离心,然后去除上清,换用新鲜的培养液,悬浮细胞直接转入细胞瓶中就可以了.没有必要再离心了
3是去除DMSO要及时,常温下对细胞的毒性还是挺大的.
还有就是我发现对于脆弱的细胞最好不要全换液,那本身对细胞就是一个刺激.
祝楼主下次复苏成功!
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发表于 2012-7-20 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

报告一下,3个星期之前复苏的细胞在全力抢救之后好象有一点转机了,活力能够达到90%.但是还是很多成团的细胞.希望能够过这一关.
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xue258[使用道具]
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 小中大

向组织汇报一下，之前的一瓶细胞在我们以极大的耐心和爱心的栽培下，终于柳暗花明了，开始长的比死的多了。新换的瓶子里面几乎只有很少的死细胞了。
但是有个问题，细胞仍然成团很厉害，而且是很大大团，肉眼都能看见培养液里的浑渚。随着细胞状态的好转是不是成团也会会慢慢好转呢？
哎，上帝保佑，一定要好好的。
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xue258[使用道具]
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 小中大

今天看细胞，昨天换液后吹散的又开始成团了。大片大片的，估计有几百个。有没有有经验的老师呢？估计是怎么回事呢？
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