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标题:[求助]取血浆后,PBMC分离,请大家看问题出在哪一步

04906[使用道具]
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发表于 2012-7-22 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]取血浆后,PBMC分离,请大家看问题出在哪一步



1 .肝素抗凝血5ml(从病房抽血,已密封静置了快2个小时).
全血离心2200转,8min
2 .取血浆2ml,余下3ml血中加入2ml hanks液,混匀重新悬成5ml稀释血
3.将此5ml稀释血逐滴加入淋巴细胞分离液6ml中,加的过程分层明显,
少量红细胞下沉.
4. 离心2000转,20min,白环层不明显,多量的颗粒层浮在红细胞层表面,淋巴细胞分离液层不少云絮状沉淀物.
5.取白环层洗涤计数,约1*10e5,损失了绝大多数PBMC.

试剂都复温了,避光冷藏保存,无菌操作.以前无菌台边抽血做,成功过很多次.
请大家帮忙看看,是什么问题.
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小野花[使用道具]
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发表于 2012-7-22 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得问题出在第一步和第三步上面。原因：1.肝素抗凝血可以在室温或4°放很长时间的。我曾经室温放过4小时，仍能分出较多ＰＢＭＣ。
2.其实你没有必要去做2200ｒｐｍ离心8ｍｉｎ那一步，这样做可能会损失很多ＰＢＭｃ。
3.在稀释血加入淋巴细胞分离液的时候，不止要分层明显，操作要及时，最好不能有ＲＢＣ下沉到管底。我曾经有几次都是这样，结果都不理想。加完后及时离心。
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summerxx[使用道具]
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发表于 2012-7-22 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.我用全血离心,是因为我要血浆做其他实验
2.稀释血往分离液上加的时候,操作及时,离心也及时,RBC每次都有少量下沉,以前都不影响结果.
3.云絮状悬物不知道是什么
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-7-22 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
絮状物很有可能是死细胞，死细胞通常会粘附甚而包裹更多的细胞形成絮状。

1、如果同时想要PBMC和血浆的话，建议降低首次离心速度，减少对细胞的损伤，而血浆量的损失其实很少。如果担心血浆中还有细胞成分，可以将血浆再次高速离心取上清。2200转对于处在两层液面之间的细胞没问题，但对于压在管底的细胞来说太高了，可以尝试800－1000rpm。

2、首次离心将血浆取出后，要加入至少相当于原总全血量的Hank's液稀释（即至少5mL)，因为细胞浓度越大越不利于不同密度细胞之间的分离，一般来讲稀释倍数多一些，管截面大一些分离效果更好。而分离液的量没必要那么多，是上层总液体量的一半就可以了。

祝好运！
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04906[使用道具]
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发表于 2012-7-22 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好的,谢谢
牛人...呵呵

800-1000的速度能离心开不?
我的意思是担心细胞没完全降下去,以前在无菌台边抽血时,离心转速用2000,吸血浆时细胞容易浑,损失PBMC .

不过静置2小时的全血,分层已大致出来了.

离心的管截面,我都是用的15ml离心管,因为据说15会比50 的离心效果好.
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lixi559[使用道具]
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发表于 2012-7-22 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以前我从医院抽取肝炎病人的外周血分离PBMC,也遇到过这种情况,其实,这并不是操作的问题,和病人的状况有关,如果他的血液中有很多的脂肪颗粒,很可能就会出现你的这种情况,另外,病人的PBMC可能也会比较少,有一次,我抽的病情比较严重的病人10ml血,还得不到1million的细胞,而且用CONA去刺激的话也不会分泌细胞因子.我个人认为,操作没错,只是个体差异而已.
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04906[使用道具]
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发表于 2012-7-22 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个体差异......那就只能算我不走运了.
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04906[使用道具]
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 小中大
2200转对于处在两层液面之间的细胞没问题，但对于压在管底的细胞来说太高了，可以尝试800－1000rpm。

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我刚在想,有必要再重新吹匀全血不?PBMC会不会沉下去了.
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2012-7-22 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议用EDTA-钾盐管抗凝
离心速度可适当增大,2500转/分也可以.
患者的情况也比较重要.SLE患者的分离效果尤其差.
或者更换淋巴细胞分离液.
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u234[使用道具]
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发表于 2012-7-22 13:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚在想,有必要再重新吹匀全血不?PBMC会不会沉下去了.

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加入Hank's后（我们是用PBS）当然要重新将细胞吹匀了。

当然有些病人的血液状态确实会导致分离效果不理想，找个正常人的血做对照试一下就知道了。

但你的操作确实有可改进之处，我的建议有益无害。我们平时离心活细胞经常1000rpm，除了血小板基本都离得下来（你想想，即使不离心静置一段时间血浆都已经很清澈了）。所以你取血浆后可再高速离心去除血小板。关于离心速度当然还要具体情况具体对待，分离PBMC取白膜层离心洗涤那次速度当然要高点，因为混有一些淋巴细胞分离液了。

15ml离心管只是白膜层看起来比较厚，视觉效果好一些，而50ml离心管白膜层显得薄一些，只要吸取得干净，我的经验是50ml离心管的总PBMC回收率更高。话说回来，如果血量比较少的时候用50ml离心管就有点浪费了。关于截面问题和稀释倍数问题是我在一本英文书上看到的，恰好也支持这一结果罢了。

肝素钠抗凝血保存的时间可长一些，我们有时时间安排不开放过夜再分离也没问题（室温），对PBMC功能影响小。但EDTAK2抗凝血要尽快分离，因为它可以鏊合钙离子，而钙离子是细胞的重要信号分子，对后续的细胞功能可能产生一定的影响。
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