[求助]有关乳鼠心肌培养时消化下来的细胞很少的问题 - 经验共享

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标题:[求助]有关乳鼠心肌培养时消化下来的细胞很少的问题

kswl870[使用道具]
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发表于 2012-7-31 14:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Ca++呢？这是很主要的问题。
还有你如何保持在消化过程（几个小时）中的PH值稳定？

kswl870[使用道具]
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发表于 2012-7-31 14:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我使用的心脏细胞分离缓冲液，是从国外文献中引用的，效果不错，第一次实验进行分离，差速帖壁后纯度约70%，第二次达到90%左右。供你参考：（建议你别使用d-hank's液）

NaCl: 120mM
NaH2PO4·2H2O: 1mM
Glucose: 5.5mM
KCl: 5.4mM
MgSO4·7H2O: 0.8mM

调整PH值到7.2~7.4，在1000ml中，加入Hepes液20ml。

tieshazhang[使用道具]
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发表于 2012-7-31 14:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上
你说的先把缓冲液调整到7.2~7.4，可Hepes是酸性的，加入之后缓冲液即变成酸性的啦

kswl870[使用道具]
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发表于 2012-7-31 14:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Hepes液20ml是买Gibco公司的成品，加入后PH值少有变化。相对稳定，可能与加入的对象原来就是缓冲有关，同时是在1000ml中加20ml，量不大。

但不加Hepes，长时间暴露会PH值不稳定。看一下不含Hepes液的1640培养在暴露时，PH值的变化你就知道了。

969[使用道具]
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发表于 2012-7-31 14:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你直接加PBS配就可以了
从你后面描述的看是根本就没有消化下来，建议加胶原酶，胰酶浓度可低点，一半0.125%足够了，组织块要剪小，不然不好分离，可以边摇晃边水浴，必要的时候加大力度，不要怕细胞被摇死，一定要把那些被细胞破损释放出来的DNA包膜包住的组织块和细胞块摇散，要是分都分离不出来还不如不消化；还有就是血清的问题，不知道你是什么小牛血清，如果是一般国产的建议加胎牛，我曾经做过对比，小牛组的连成纤维都不贴壁，而胎牛组只需要差速分离1个小时就有心肌贴上去了

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