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标题:[求助]FICOLL分离人脐血单个核细胞

abc816[使用道具]
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发表于 2012-8-9 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]FICOLL分离人脐血单个核细胞


我先将脐带血用PBS等体积稀释，然后用等体积的FICOLL淋巴细胞分离液，2500r/min，离心30min 。但是离心完毕后，血清下面的云雾状单个核细胞层与下面的淋巴细胞分离液分界不清。以前也做过相同的操作，有几次结果层次还是很分明的。究竟问题出在什么地方呢，有几点疑问请各位参考：
1.FICOLL淋巴细胞分离液质量问题。（我用的是上海的）
2.离心转数和时间
3.我用的是50ml的大离心管，这次加的终体积是40ml ，体积大了对离心的层次有影响吗？
请有此方面经验的大侠给予帮助，先谢！
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2012-8-9 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞+pbs不要和Ficoll等体积，这样会改变FIcoll的组成，细胞的体积尽量少
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dog002[使用道具]
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发表于 2012-8-9 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我分过太多次的人外周血PBMC,像你说得情况时常发生.
1 上海FICOLL的质量应该没问题
2 离心转速和时间很有讲究,这和你所用的脐带血的浓度和体积有关.你的问题我建议这样:脐带血用PBS等体积稀释可以.10ml血加到20mlFICOLL上.如果常规2500rpm30min分界不清,可继续2500rpm10min或20min,直到分界清楚.或提高一点转速用2600rpm30min.
祝你好运
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2012-8-9 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

脐带血与PBS的稀释比例要增大至1：2～1：4

离心机最好为可以设置加减速的那中，一般分9级，设为3或4均可
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ffooll[使用道具]
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发表于 2012-8-9 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分界不清与离心的转速无关，关键只有2点：
1. 加稀释的血液时太快，冲混了部分分离液。
2. 离心机的制动过快，离心停止使的突然刹车震荡了液体，导致界面的两种液体混合。
由于50ml离心管的直径大，更易因上述原因而发生分界不清。
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-8-9 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

50ml离心管可能确实因为直径大,分离的效果不如10ml试管.
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-8-9 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

50ml离心管可能确实因为直径大,分离的效果不如10ml试管.

[ 本帖最后由 dragonkilly 于 2012-8-10 14:52 编辑 ]
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-8-10 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
1.　在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
　　2.　取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
　　3.　离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
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abc816[使用道具]
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发表于 2012-8-10 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有一个遗留的问题就是：脐血分离后在云雾状那层有类似组织块的物质，不知为何，请各位指点。
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一叶[使用道具]
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发表于 2012-8-10 14:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 abc816 于 2012-8-10 14:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

还有一个遗留的问题就是：脐血分离后在云雾状那层有类似组织块的物质，不知为何，请各位指点。

应该是黏附在一起的白细胞（血小板），可以吹散的。
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