细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]质粒转染的问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:[求助]质粒转染的问题

woshituzhu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75774
精华 1
积分 384
帖子 443
信誉分 102
可用分 3001
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-27
状态 离线
1
 

[求助]质粒转染的问题

我用脂质体进行质粒转染后,第二天细胞全部死了,请教是什么原因?我的操作都是按说明书进行的,质粒也是我按说明书提取的。
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
2
 

可考虑以下原因:
1.培养基必须在转染24小时前换用无双抗的。
2.质粒虽然是按说明书提取的,但要看清楚质粒提取试剂盒是否可以去除内毒素。
3.如果选用Invitrogen Lipofectamine 2000,它提供的参考步骤并不一定是你选用的培养板规格,须参照后面的列表.
4.培养板非常容易污染,必须排除微生物污染的可能.
5.可以考虑转染5小时左右吸去转染液体,换用含血清的培养基继续培养.
6.转染前你培养了多少时间?如果进行顺式转染,必须在细胞生长达到70-80%再进行转染
顶部
toy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77357
精华 0
积分 716
帖子 1052
信誉分 100
可用分 6165
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
3
 

试试把脂质体剂量减小点,我感觉说明书上推荐的浓度通常偏高,你可以用较小的剂量试试。
当然前提是,确实没有污染或者上面rmwdxy9说的问题。
祝你好运!
顶部
woshituzhu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75774
精华 1
积分 384
帖子 443
信誉分 102
可用分 3001
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-27
状态 离线
4
 

我是用的Invitrogen Lipofectamine 2000转染,是参照后面的列表,我的培基一直没用抗生素,转染时细胞已长满了.同板没转染的长的很好,我是转染12小时后准备换含血清培基是发现全死了,质粒提取试剂盒是Promega的.不知还有哪些该注意的?不知各位在质粒提取后怎么处理的?我是在提取后先用无水乙醇沉淀(-20度)两小时,然后用70%的乙醇-80度过夜.离心吹干后用水溶解,不知是不是最后没吹干残留乙醇的缘故否?我吹了2小时都不怎么干就加水了.请各位指教.
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
5
 

个人认为你还可以考虑以下方面:
1.请确认你的Lipofectamine 2000是否已经过期,经过我们实验室的实践:尽量使用开封半年内的Lipofectamine 2000,因为过了半年后,就算没有过失效期,但是细胞毒性大大增加,而转染效率却大大下降。
2.确认你在使用Promega质粒提取试剂盒是使用了内毒素去除树脂(Endotoxin Removal Resin)。
3.按照Promega质粒提取试剂盒的protocol,在第19步加入nuclease-free water后直接放入-20或-80度冻存就可以,我们没有另外沉淀。
4.去除质粒提取中的酒精可以试用下面的方法:将Ep管倒置在灭菌的滤纸上,大概10-20分钟后就可以干了,注意不要时间过长,否则太干了,不太好溶解。
5.你可以尝试适当减低转染试剂的用量,并在转染5小时时观察细胞情况,并且换10%FBS的培养基,看看情况怎么样,因为转染液对细胞的损伤非常大。
祝您实验成功!
顶部
101010[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75120
精华 0
积分 517
帖子 734
信誉分 100
可用分 4490
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
6
 

各种培养细胞或细胞株对转染试剂的毒性敏感程度不一样, 脂质体的毒性大一些, 如果是转染试剂的问题,建议使用毒性低一些的转染试剂,如阳离子聚合物转染试剂,可以试试梭华-sofast。
顶部
xingyi08[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76899
精华 0
积分 496
帖子 671
信誉分 100
可用分 4201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
7
 
我们用Invitrogen Lipofectamine 2000转染时,量全部都是减半的、感觉说明书上推荐的浓度过高了。
顶部
woshituzhu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75774
精华 1
积分 384
帖子 443
信誉分 102
可用分 3001
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-27
状态 离线
8
 

呵呵,请问什么叫顺式转染呢?
顶部
woshituzhu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75774
精华 1
积分 384
帖子 443
信誉分 102
可用分 3001
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-27
状态 离线
9
 
请问你提到的顺式转染是什么意思呢?
顶部
DDD[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73222
精华 1
积分 587
帖子 790
信誉分 102
可用分 4768
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
10
 


QUOTE:
原帖由 woshituzhu 于 2012-8-13 11:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问你提到的顺式转染是什么意思呢?

瞬时转染~~
顶部