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标题:[讨论帖]常用原代动物细胞培养

plaa[使用道具]
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发表于 2012-8-16 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
乳鼠肝脏细胞原代培养

一周龄大鼠，断颈处死，活力碘消毒,无菌取出肝脏，于无菌维持液中漂洗，用眼科剪仔细清除肝包膜,韧带,沿肝边缘剪切肝尖组织(绕开肝蒂等)转入青霉素小瓶中，用眼科剪绞碎,剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，加入5倍体积无菌维持液,用滴管轻轻吹打,吸出上层血细胞,再用无菌维持液反复清洗3~5次，加入10倍体积无菌胰蛋白酶消化液,37℃消化，消化过程中不断震荡，至组织块边缘变薄(镜下观),离心(1000rpm,10分钟)弃去上面酶液，用无菌维持液将组织块清洗2~3次，加入新鲜无菌胰蛋白酶消化液重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，1000rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌维持液悬浮，离心，洗1~2次，用20%生长液悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于塑料培养瓶中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。培养48小时后，换新鲜配置的培养液培养5小时，可除去绝大部分血细胞及杂细胞，37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层肝细胞.
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orangecake[使用道具]
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发表于 2012-8-16 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看来看去俺那个还是冷门啊
人和大鼠的前列腺基质细胞原代培养 呵呵
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jkobn[使用道具]
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发表于 2012-8-16 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家好！这是第一次上论坛，请大家多多关照！
有谁做过猪心肌细胞的原代培养，能交流一下吗？
或者在哪里能买到这株细胞？急！
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-8-16 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

猪肺泡巨噬细胞的培养可以吗？
1、细胞培养所用溶液及其配制
1×RPMI1640及：按照产品说明配制，过滤除菌，4℃保存备用。
新生牛血清：56℃灭活30min，-20℃保存备用。
2×104U/ml青、链霉素液（双抗）：青链霉素各2×106 U溶于100ml灭菌双蒸水中，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
10×Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%）：Na2EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g ，Na2HPO4.12H2O 2.89g，KH2PO4 0.2g，1%酚红溶液1.5ml，胰酶（1:250）2.5g，溶于100ml双蒸水中，NaOH调节pH至7.2~7.5，过滤除菌，分装，-20℃保存备用，使用时1∶10倍稀释。
7.5%NaHCO3： 7.5g NaHCO3溶于100ml双蒸水中，115℃高压灭菌15min，置4℃冰箱冷藏备用。
10% RPMI1640营养液：于1×RPMI1640溶液中加入10%小牛血清，按照1% 比例加入2×104U/ml双抗，用7.5% NaHCO3或10% HCl溶液调节pH值至7.2~7.4。
2、将50日龄的SPF仔猪放血，结扎气管后无菌摘取其肺脏，先用0.9%的生理盐水洗涤外表面，将pH7.2的PBS30.0ml从气管灌入肺脏，轻轻拍打肺表面，1~2min后回收灌洗液，如此反复进行，直至灌洗液清亮为止。将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打，将细胞团块打散，用单层无菌100目不锈钢筛过滤，收集全部灌洗液，2000r/min离心10min，收集沉淀。洗涤两次后加入适量含10%胎牛血清的1×RPMI1640营养液吹散细胞，置培养瓶或培养皿中于37C CO2培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非黏附细胞继续用含10%胎牛血清的1×RPMI1640培养液培养备用。


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发表于 2012-8-16 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵，来晚了，我养大鼠心肌微血管内皮细胞2年了，方法很成熟，能否呢？
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发表于 2012-8-16 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞的原代培养。
将出生2天以内的新生SD大白鼠10只，用75%的酒精浸泡消毒后，采用无菌方法迅速取出大脑，用冷的D-Hanks液清洗并剔除脑膜和血管，取大脑皮质，将组织剪碎为1mm3，用0.125%胰蛋白酶,37ºC消化10分钟，过滤（200目尼龙滤网），离心（1000rpm 10分钟），去上清，加入DMEM/F12完全培养基（其中含10%胎牛血清，10%马血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100u/ml,链霉素100μg/ml）制成细胞悬液。计数后按5×105/cm2接种于培养瓶。贴附30min后，转移细胞悬液至新瓶中，加入DMEM/F12完全培养基，在37ºC, 5%CO2培养箱中培养9天（每3天更换培养液一次），第9天将培养瓶置于恒温旋转摇床上37ºC, 240rpm，摇18小时，去掉悬浮的细胞，用D-Hanks液清洗3次，进行传代培养即得纯化的星形胶质细胞。经免疫细胞化学法检测，98%以上的细胞GFAP免疫反应为阳性。
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发表于 2012-8-16 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我养过Ⅰ和Ⅱ大鼠星形胶质细胞、神经元。而且养过BHK-21、COS7、C6、和Hela四种细胞，有问题者，可以共同探讨。
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 小中大
神经细胞培养

一．设备： 无菌操作设备。

二．大型设备CO2培养箱：恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。

倒置显微镜：用于每天观察贴壁细胞生长情况。

解剖显微镜，用于准确地取材。

常温冰箱：-4℃，用于保存各种培养液，解剖液和鼠尾胶。

低温冰箱：-20℃--80℃，用于储存血清酶，贵重物品和试剂。

电热干烤箱：用于消毒玻璃器皿。

高压消毒锅：用于消毒培养皿，手术器械。

过滤器：配制解剖液、培养液，必须过滤后才可使用，以去除细菌。

渗透压仪，pH剂，天平等。

三．培养器皿及手术器械

1。培养皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直径。

2。培养板，24-40孔，可用于开放培养。

3。培养瓶：

4。吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。

5。各类培养液贮存器。

6。小型手术器械。

准备：

一 配制培养液

（1）解剖液：以无机盐（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS缓冲液，保持一定的渗透压和pH值。

（2）基础培养基（MEM）：主要为多种氨基酸，加入葡萄糖，双蒸馏水溶解。

（3）接种培养液：用于胰酶消化后的细胞分散，做成细胞悬液，其成分为MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%马血清，当天配制。

（4）维持培养液：接种后24h，全部换成此液，后每2周换一次，每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清，1%谷氨酰胺，及适量的支持性营养物质。
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 小中大
二 培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶，多聚赖氨酸，再涂胶

三消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗2-3d，达两次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包装，置于烤箱中干燥消毒，于培养前1天进行。

神经细胞分散培养

（一）选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。

（二）取材。脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。

（三）细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1×106），做电生理应为5×105或更低。

（四）抑制胶质细胞生长。培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。

（五）观察。接种6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面，形成地毯，2周时神经细胞生长最丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡，一般培养2-4周最宜。

但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。
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 小中大

这是以前的方法，现在有所改进，有现成的神经元培养添加剂：B27,即可。
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