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标题:[讨论帖]常用原代动物细胞培养

guagua[使用道具]
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发表于 2012-8-16 12:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
偶也报个名：
人神经母细胞瘤的原代培养、裸鼠荷瘤实验以及裸鼠肿瘤的原代培养，偶全做过，都很理想。
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-8-16 12:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

斑竹:你是一个有创见的斑竹,只是我刚开始一个新的领域(对我而言):外周血内皮祖细胞,挺困难的,刚进入正轨,提议你把这方面的也加进去,因为目前有大量的文献和工作涉及这方面,在组织工程,基因治疗,缺血性血管疾病的治疗等方面有极大前景.到时我可以加上我的体会.
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泡泡[使用道具]
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发表于 2012-8-16 12:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
报名：我养的家兔和人的椎间盘细胞，为类软骨细胞，原代培养半年多了。申请参加。
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一叶[使用道具]
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发表于 2012-8-16 12:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
斑竹:你是一个有创见的斑竹,只是我刚开始一个新的领域(对我而言):外周血内皮祖细胞,挺困难的,刚进入正轨,提议你把这方面的也加进去,因为目前有大量的文献和工作涉及这方面,在组织工程,基因治疗,缺血性血管疾病的治疗等方面有极大前景.到时我可以加上我的体会.

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偶不是那个有创见的斑竹啊，不过你说的是对的外周血内皮祖细胞在组织工程里用的很多
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one[使用道具]
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发表于 2012-8-16 12:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能否加上原代乳鼠骨骼肌细胞培养？
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bgf5[使用道具]
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发表于 2012-8-16 12:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）亲自做过，
鼠胸主动脉培养亲自做过。

这两种可以来写。

3.脑微血管内皮细胞培养
4.肺微血管内皮细胞培养
看过，自己没有做过。

原代肿瘤细胞看实验室实验技术师做过。
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plaa[使用道具]
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发表于 2012-8-16 12:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有没有哪位养过原代胰岛B细胞啊？
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2012-8-16 12:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对于楼上介绍的：乳鼠心肌细胞培养方法详述 ，我也来谈谈自己的一点经验：

1。取材时：直接将小鼠浸入75%的酒精小烧杯中10秒钟左右，然后将小鼠用镊子夹出，放入超净台内准备好的灭菌平皿中，这样一次将10只小鼠全部浸泡消毒后，全部操作就在台内完成。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，然后用75%的酒精棉再次消毒胸腹。小眼科剪沿胸骨屏左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。这样只要左手稍顶，一颗扑通扑通跳动的小心脏就直接跳出来。然后用弯头眼科镊夹住心脏中部，就可以直接将心室部分夹下，放入冰浴的D-Hank's液中。然后在分离残血和结缔组织，剪碎组织。

2 消化这一步骤：参考文献后，我选用80U/ml的II型胶原酶和0.5mg/ml的胰酶 的配方进行复合消化。这样在消化过程中，组织块很容易消化。否则由于心肌致密的组织结构，胰酶要消化不下8次才能完全将组织块完全消化。如果每次消化时间是15分钟的话，基本上3次消化就可以完全了。

3，尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。
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jujuba[使用道具]
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发表于 2012-8-16 12:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有谁成功建立过小鼠皮下种植瘤模型？传授点经验及教训。不胜感激！
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2012-8-16 12:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大鼠皮层神经元原代培养

液体配制：
硼酸硼砂缓冲液：0.05M四硼化钠45ml，0.2M硼酸55ml，pH8.4；
胰酶－EDTA消化液：胰酶－0.125g；EDTA－0.2g；D-Hanks平衡盐液定容至100ml
所用的培养板、培养瓶或玻片预先经100μg/L多聚赖氨酸硼酸盐缓冲液于37℃包被4h，三蒸水洗三遍晾干备用。

操作步骤如下：
1。  孕16d SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks平衡盐液中。

2。  在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。

3。  随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液（DMEM＋10％FBS）的离心管内终止消化液作用5min。

4。  用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10％FBS的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。

5。  将所收集的上清经200目筛网过滤。

6。  过滤后的细胞悬液于800r/min离心5min，弃上清，管内加入新鲜培养液（DMEM＋20％FBS）并吹打成单细胞悬液。

7。  细胞计数，调整细胞密度按1.5×105/cm2种入6孔板内，放入CO2孵箱中培养。培养48h后换液并加入Ara-C使其终浓度为1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量换液。以后每隔3天半量换液一次。

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