[讨论帖]常用原代动物细胞培养 - 经验共享

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标题:[讨论帖]常用原代动物细胞培养

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发表于 2012-8-16 13:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1．材料
1．1． 10-12日龄非免疫受精鸭胚购于雅安偏远山区
1．2．标准胎牛血清(FBS) Tianjin.h&y bio.co;ltd
1．3． MEM营养液（细胞增殖液；细胞维持液；洗液） GIBCO
Invitrogen Corporation
1．4． 10倍胰酶（自配）
1．5．抗生素医用80万单位青霉素和医用100万单位链霉素
1．6．灭菌的无钙、镁平衡盐溶液（自配）
2．实验器材与仪器
2．1实验器材
国产玻璃螺旋口细胞培养瓶（100ml）；培养皿；离心管（10ml）移液管（10ml与1ml）；漏斗；10层纱布；三角锥瓶（100ml）；吸耳；酒精灯；酒精（75%）；碘酒(3%)；火柴；瓶塞；镊子；滤器及配套滤膜（25mm直径孔径0.22um）；50ml注射器；烧杯；蛋座；记号笔；离心管架；金属饭盒；照蛋器。
2.2 实验仪器
仪器名称  产地
超纯水仪  Water pro ps.labconco
电子天平  ShangpingFA2004. 上海天平仪器厂
高压灭菌仪  HIRAYAMA4
双蒸水仪  上海亚荣生化仪器厂
Orion台式PH测试仪  868型 OrionResearch.Inc
倒置显微镜  OLYMPUS
细胞培养箱  Queue
台式高速低温离心机  Beckman coultertm
超净台  苏州安泰空气技术有限公司
水浴锅  国华电器有限公司
低温冰箱  海尔集团
电热恒温鼓风干燥箱  DHG-9140型上海精宏实验设备有限公司
3.4 原代鸭胚成纤维细胞的制备。（10×ATV消化法）
实验前，无菌室用紫外线照射30min以上；超净台使用前应彻底擦干再用0.1%苯扎溴铵（新洁尔灭）擦拭一遍。双手和瓶子表面用75%的酒精消毒。(以下步骤参考文献[2][4][5][6]进行的)
①取10-12日龄发育良好的鸭胚，气室向上置于蛋盘内，用碘酒擦拭鸭蛋表面，后用酒精脱碘，并在气室端打一小孔，沿气室用镊子小心剪去蛋壳露出气囊，以镊子去除覆盖于绒毛尿囊摸上的白膜，暴露出尿囊膜及附着的血管。用镊子撕开尿囊膜，夹住鸭胚颈部，移置于一小培养皿中。
②去除胚的头，四肢和内脏，用基础营养液清洗2-3次，直至组织出现透明，倒尽清洗液。
③用眼科剪剪碎胚体直至0.1-0.5立方毫米。剪越碎越好。
④移组织碎块于三角锥瓶内，加0.2ml/胚的10×ATV 37℃水浴锅内温热消化 2min，后用吸管移至离心管中,用离心机5000rpm 离心5min弃上清液。
⑤加入含双抗的10%血清的基础营养液，移离心管下层组织碎块于三角锥瓶内，由于分散的细胞在没有胰蛋白酶的作用下，会很快聚合成小团，为减少细胞成团应不断吹打，直至成细胞全部分散开。
⑥取灭菌纱布叠成8-10层置于漏斗上并使中部略凹陷，以含双抗的10%的基础营养液润湿纱布，将已吹散的细胞悬液经纱布过滤除杂。
⑦过滤后的细胞悬液补加含有双抗的10%血清的基础营养液，按10ml装入细胞培养瓶（容量为150ml的细胞瓶），将细胞瓶置于37℃细胞培养箱内静置培养。2小时后观察细胞贴壁情况，24小时后确认无污染。一般情况，24小时后细胞可基本长成单层。

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发表于 2012-8-16 13:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教战友，用无CO2供给的培养箱培养24孔盘原代细胞的方法。关键注意问题有什么？PH会不会出现大的变化？

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发表于 2012-8-16 13:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

猪甲状腺细胞原代培养方法
1.材料
猪甲状腺由锦州市屠宰场提供。F-12培养基（sigma公司）；胎牛血清（天津血液研究所）；胰蛋白酶（sigma公司）；胶原酶Ⅳ（sigma公司）；牛TSH　　　　　　（sigma公司）
2.方法
杀猪后迅速取出甲状腺1～2个，置于盛有75％酒精的烧杯中，用冰盒送至实验室（1小时以内）。立即置于pH为7.4的PBS缓冲液（含青链霉素）中，反复漂洗，直至漂洗液清澈透明。去除包膜及结缔组织，用眼科剪子、镊子将甲状腺组织剪成１mm3大小的碎块。置含0.25％胰酶和300U/ml胶原酶的容器中，放于37℃温箱中消化60min，每隔15min需摇动一次。用吸管将上清液的三分之二吸入离心管中，并加入含有胎牛血清的培养基终止消化。以1000转／分钟离心10分钟后，弃上清。将细胞沉淀用F-12培养基制成细胞悬液，充分吹打并用不锈钢网（200目）过目，再1000转／分离心10分钟，弃上清。沉淀悬于含15％胎牛血清和１U/L牛TSH的F-12培养基中，台盼蓝染色证明活细胞数大于95％，调整细胞浓度接种于培养板中（１ml／孔）。置于37℃的5％CO2孵箱中，每二至三天换一次液，至细胞融合成片后用于实验。
3.结果
猪甲状腺细胞培养24小时，镜下细胞贴壁，呈聚集生长，细胞呈圆形或椭圆形。
4.讨论
胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织如上皮组织、肝、肾等，对传代细胞也非常好。但消化纤维性组织或较硬的癌组织则效果较差。胶原酶对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。由于甲状腺富含纤维性组织，所以甲状腺的消化分离一般采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法，用单一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲状腺激素（TSH）是培养甲状腺细胞必备的，它能够起到促进甲状腺细胞生长的作用。本人也曾尝试过不加TSH，与加TSH对比明显可见细胞增长较慢，且形态不好。

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2012-8-16 13:24

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发表于 2012-8-16 13:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

细胞原代培养
材料：小鼠
器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器
试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胶原酶、PBS
准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
操作步骤：
1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、睾丸或卵巢，置于盛有PBS的平皿中。
2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胶原酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。
6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。
8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

细胞记数：取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。

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小中大

心肌细胞的分离及培养
器械：饭盒、烧杯、弯头解剖剪（2）、小镊子（2）、平皿（4）、毛玻片、滤网、离心管（15ml）、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒
溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶
动物：小鼠
准备：用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束，提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。
培养过程：
1. 两个圆皿中加入5ml的PBS培养液，将小鼠浸入70％酒精<5min，用小剪子及小镊子开胸取心。
2. 取出的心放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。
3. PBS再冲洗后，转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中，用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入15ml离心管中，加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。
4. 放入水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。
5. 再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管，吸管轻轻吹打1min，消化10min，小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中，细胞悬液离心，1000转×10min，弃上清，加培养基为管1。
6. 重复第5步，3-8次，直至至组织块消化为止。
7. 将多次细胞悬液经100目滤网过滤，混合。
8. 加入1ml DMEM重悬，显微镜下观察并计数。
9. 培养1-1.5小时，收集培养液中的非贴壁细胞，小心不要晃动。
10.显微镜观察并计数，细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。
11.4-6小时后，用培养基轻轻冲洗2次，加入培养基继续孵育过夜。

或从第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37℃水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培养基终止。

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肝细胞原代培养
材料：小鼠
器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器
试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS
准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
操作步骤：
1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。
2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。
6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。
8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

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发表于 2012-8-16 13:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人最近正准备做人甲状腺细胞培养，看到您的帖子喜出望外，还有几点疑问想请教xiaoma793：
1.您贴上来的照片是已经贴壁的细胞吗？这种状态是否传代时可以不用胰酶消化，直接吹下来就可以了？
2.甲状腺是血液循环非常丰富的组织，分离细胞时常有较多红细胞混杂，您是用什么方法去除的？
3.以您的经验，这种方法培养的甲状腺细胞最多能传几代？
盼望您的指点！

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发表于 2012-8-16 13:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

DEF图

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2012-8-16 13:26

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okhaha[使用道具]
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发表于 2012-8-16 13:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

DEF单层细胞图片~~~~~~~

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发表于 2012-8-16 13:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养

脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的重要成分，与外周血管内皮细胞不同，它具有高跨内皮阻抗（transendothelial electrical resistance，TER）、细胞间紧密连接、极少的胞饮小泡、缺乏窗孔结构以及含有选择性双向跨细胞膜转运系统等独有的特征，从而使血脑屏障形成一个限制大多数极性分子和蛋白质运动的选择性低渗透性的屏障[1]。由于体外培养的脑微血管内皮细胞保持了较多的其体内固有的特点[1]，因此目前脑微血管内皮细胞体外培养模型已被广泛应用于血脑屏障的研究、脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究、新药筛选、脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究等领域。而大多数体内实验采用大鼠为动物模型，而且大鼠具有较多的细胞生物学研究所需的抗体可用，因此进行大鼠脑微血管内皮细胞的培养具有重要的意义。自从Panula等[2]首次成功培养大鼠脑微血管内皮细胞以来，国内外有关大鼠脑微血管内皮细胞的分离和培养方法已有较多的报道，我们发现国内的方法多以组织匀浆、两次尼龙网过滤分离脑微血管段为主[3,4]，也有采用酶消化、梯度离心及尼龙网过滤的[5]，但细胞得率均较低，而近些年来国外大多数方法采用以大脑皮质为材料、酶消化及梯度离心分离脑微血管段并进行原代培养[6~9,11,12]。由于原代培养中无法避免地混杂成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞、星型胶质细胞等其他细胞的生长，而且工作量大、过程繁琐且费用高[1]，进行较纯的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养一直是国内外的一个难点。
本人参照文献[6]、[7]、[8]的方法，成功地摸索出大鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养的方法，并获得纯度较高的脑微血管内皮细胞。

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