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标题:[讨论帖]常用原代动物细胞培养

xevin[使用道具]
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 小中大
1 材料与方法

1.1 实验动物
每次实验采用10只2-3周龄SD大鼠，雌雄均可，体重40~60 g。
1.2 试剂
纤连蛋白（fibronectin），Ⅳ型胶原，鼠尾胶，葡聚糖（dextran，分子量100~200kDa），DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ）购自Sigma公司；D-Hanks液，PBS，10×PBS按配方自制；Ⅱ型胶原酶购自Worthington公司；明胶，牛血清白蛋白（BSA），HEPES购自Amresco公司；Percoll购自Amersham Biosciences；DMEM（高糖）购自Gibco BRL公司；肝素钠，NaHCO3购自中国医药集团上海化学试剂公司；青、链霉素购自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清（FBS）购自PAA Laboratories；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），胶原酶/分散酶（collagenase/dispase）购自Roche公司。
1.3 重要仪器
低温离心机（1 Centrifuge 5810 R，购自Eppendorf；2 himac CR 22F，购自Hitachi）
1.4 试剂配制
1 mg/ml鼠尾胶（用0.2%乙酸配制），1%明胶（用D-Hanks液配制），1%Ⅱ型胶原酶（用DMEM配制，用时稀释成0.1%的浓度），1%胶原酶/分散酶（用DMEM配制，用时稀释成0.1%），15%葡聚糖（用PBS配制），20%BSA（用DMEM配制，调pH值至7.4后用0.45 um滤膜过滤除菌，较难过滤！），DNase Ⅰ（用冷PBS配制成2 U/ul），以上试剂经0.22 m滤膜过滤除菌后分装保存于-20 ℃；50%Percoll(配12 ml,需6 ml Percoll原液, 0.67 ml 10×PBS, 0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培养液（含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素钠 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 ug/ml），pH值调至7.4，过滤除菌后分装保存于4 ℃，用时加入20%FBS，1 ng/ml bFGF。
1.5 培养皿处理
涂布3种不同的基质：培养前一天加入1 ml 1%明胶于35mm塑料培养皿，置于37 ℃培养箱过夜，接种前用D-Hanks液漂洗2次；接种前4 h，加入鼠尾胶6~10 ug/cm2，在密闭的器皿里用氨气熏5~10 min后，置于室温1~2 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次；50ul 0.1%纤连蛋白、50ul 1 mg/ml Ⅳ型胶原和400ul双蒸水混合后，加入到每个培养皿中涂布均匀后吸出，可涂布10个培养皿，置于37 ℃培养箱1~2 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次。
1.6 脑微血管段的分离与脑微血管内皮细胞原代培养
大鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑置于盛有冷D-Hanks液的玻璃培养皿中解剖去除小脑、间脑（包括海马），随后将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管后置于新的含冷D-Hanks液玻璃培养皿中，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质，用D-Hanks液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培养液，用虹膜剪将其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型胶原酶（含30 U/ml DNase I，1 ml/大脑）混匀后37 ℃水浴消化1.5 h，离心（1000 r/min，8 min，室温），去上清液，加入20%BSA悬浮混匀后离心（1000 g，20 min，4 ℃）或加入15%葡聚糖悬浮混匀后离心（4000 r/min，20 min，4 ℃），去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀，加入2 ml 0.1%胶原酶/分散酶（含20 U/ml DNase I）悬浮混匀后37 ℃水浴消化1 h，离心（1000 r/min，8 min，室温），去上清液，加入2 ml DMEM培养液悬浮后铺于经离心形成连续梯度的12 ml 50%Percoll（25000 g，60 min，4 ℃），离心（1000 g，10 min，4 ℃），靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗两次（离心1000 r/min，5 min，室温），去上清液，加入DMEM完全培养液（含20%FBS，100 ug/ml肝素钠）悬浮后接种于涂布基质的35 mm一次性塑料培养皿（1.5 ml/培养皿，可接种1个培养皿/大脑），置于37 ℃、5%CO2培养箱内静置培养，12~24 h后换液，并加入1 ng/ml bFGF，随后隔天换液。
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 小中大
1.7 鉴定方法
形态学、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测

2 结果

2.1 细胞形态观察
接种当时可见由圆形的内皮细胞构成的呈单枝状或分枝状的脑微血管段，并可见散在的单细胞及组织碎片（见图1-1）；培养12~24 h后可见培养的细胞从贴壁的微血管段周围长出，细胞呈短梭形，区域性单层生长，经换液后微血管段的残余部分不断减少，成纤维细胞、周细胞等杂细胞含量较少；随着培养时间的延长，内皮细胞不断增殖，可见“旋涡状”分布，大约5~7天细胞达到融合，短梭形的内皮细胞占90%以上，但可见少量周细胞等杂细胞生长于内皮细胞单层表面或细胞克隆间隙（未示）。细胞生长过程见图1，细胞接种于纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿。
2.2 涂布不同基质的细胞生长情况
明胶及鼠尾胶涂布的培养皿微血管段贴壁时间较长，6 h可见少量微血管段贴壁但无内皮细胞长出，12~24 h可见一些内皮细胞长出，24 h后脑微血管段完全贴壁并有较多的内皮细胞长出，两者无明显差异（见图2-1~4）；纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿培养后6 h即可见微血管段贴壁并有一些内皮细胞长出，12~24 h内基本完全贴壁并有较多的内皮细胞长出（见图2-5,6）。
2.3 免疫组化
Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测可见培养的脑微血管内皮细胞的胞浆及核周有棕黄色着色，胞核呈空泡状结构；对照染色为阴性。

3 讨论

我们采用两次酶消化、梯度离心分离得到脑微血管段，探索各种不同的培养条件，成功地进行了较纯的大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养，内皮细胞纯度可达90%以上，而且细胞得率较高，10只动物可培养8~10个35 mm一次性塑料培养皿，培养面积大约80~100 cm2，与国内的一些方法[3~5]相比，细胞得率有明显的提高。
由于新生鼠易于混有较多的杂细胞且大脑较小以及哺乳期大鼠优于超过1月龄的大鼠[9]，我们采用2~3周龄哺乳期的SD大鼠作为培养材料。脑微血管内皮细胞原代培养的关键是首先分离获得纯度较高且活力好的脑微血管段。在解剖过程中仔细去除软脑膜、大血管及大脑白质收集大脑皮质，可减少成纤维细胞和平滑肌细胞的生长，对于提高内皮细胞的纯度具有重要意义。由于胶原酶对内皮细胞的损伤较小，我们采用0.1%Ⅱ型胶原酶消化剪碎后的大脑皮质分散组织，同组织匀浆法[3,10]相比，酶消化法可避免组织匀浆对内皮细胞的损伤，从而有利于提高细胞的活力。经胶原酶消化后采用20%BSA或15%葡聚糖离心可分离脑微血管段与神经组织及大血管，得到底层的脑微血管段，这种方法被广泛应用于脑微血管段的分离[5~9,11,12]，我们发现20%BSA较15%葡聚糖而言，其分离获得的脑微血管段数量更多，而且脑微血管段状态更好更易贴壁生长。由于周细胞是脑微血管内皮细胞原代培养中最常见的杂细胞，它会明显抑制内皮细胞的生长[7]，因此原代培养中应尽量减少周细胞的数量，我们采用两次酶消化方法[7]，控制两次酶消化的时间，用0.1%胶原酶/消化酶分散出内皮细胞外围的周细胞，最后采用一定浓度的连续梯度的Percoll分离以去除周细胞和红细胞得到较纯的脑微血管段。在酶消化过程中加入适量的DNA酶可分散消化过程中释放的DNA所引起的微血管段凝结块，有利于增加微血管段的得率。对于Percoll离心，我们尝试了3个浓度（33%、45%及50%）后发现，浓度越大，脑微血管段离靠近离心管底的红细胞及周细胞越远，分离效果也越好，因此采用50%Percoll效果最好，并且最好采用水平转头的低温离心机以提高离心效果。内皮细胞纯化的其他方法有机械刮除法、克隆培养法、FACS分类法[13]、Thy1.1免疫反应杀伤法[7,14]、采用血浆来源的胎牛血清[8]、磁珠结合法[10]等，但是我们发现机械刮除法和克隆培养法并不适合大鼠脑微血管内皮细胞的纯化，因为原代内皮细胞传代后状态不佳且易被杂细胞所抑制[7]，而后面几种方法比较昂贵不予推荐；血浆来源的胎牛血清不含PDGF，不促进杂细胞的生长，但是其较昂贵，可选择胎牛血清用于原代培养。
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发表于 2012-8-16 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
脑微血管内皮细胞的原代培养需要涂布明胶、鼠尾胶、纤连蛋白等基质以利于脑微血管段贴壁和内皮细胞的生长。我们尝试不同基质后发现其对脑微血管段的贴壁和内皮细胞的生长作用不同，纤连蛋白/IV型胶原优于鼠尾胶，而鼠尾胶比明胶好，而且接种密度的要求前者比后两者要低，后两者需要达到一定密度才有利于脑微血管段贴壁。另外我们发现内皮细胞不易生长于玻片上，而较易生长于塑料培养皿上，这与文献报道基本相符[8,14]。内皮细胞生长需要添加内皮细胞生长因子以促进内皮细胞的增殖抑制杂细胞的生长，我们采用bFGF可有效促进内皮细胞的生长，同时添加100 ug/ml肝素协同bFGF的作用并可抑制平滑肌细胞的生长[9]。同时为了保证内皮细胞的营养，并去除脑微血管段的残余碎片，我们采用20%FBS的血清浓度并隔天换液。
我们培养的脑微血管内皮细胞呈短梭形，区域性单层生长，随着培养时间的延长及内皮细胞的增殖，可见“旋涡状”分布，约5~7天后，各区域之间可逐渐融合，其形态和生长特点与大多数文献报道相似[6~9,11,12]。根据内皮细胞的短梭形的形态特点、Ⅷ因子相关抗原表达阳性可鉴定我们所培养的细胞确为脑微血管内皮细胞[3,5,8]。
我们的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养模型的建立，对于研究脑内皮的生理、生化及药理研究是一个较好的工具，同时可与星型胶质细胞共培养用于构建血脑屏障模型[1]。相信随着技术方法的不断改进，脑微血管内皮细胞体外培养的模型将逐渐接近于其在体特征，并被广泛应用于相关研究[1]。

参考文献（References）
[1] Grant GA et al. News Physiol Sci, 1998, 13：287
[2] Panula P et al. Experientia, 1978, 34：95
[3] 王建民等。解剖学杂志，1998，21：495
[4] 许彦钢等。微循环技术杂志，1997，2：63
[5] 钱志远等。细胞生物学杂志，1999，21：42
[6] Kis B et al. Neuroreport, 2001, 12：4139
[7] Szabo CA et al. Neurobiology (Bp), 1997, 5：1
[8] Abbott NJ et al. J Cell Sci, 1992, 103：23
[9] Gordon EL et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1991, 27A：312
[10] Diglio CA et al. Lab Invest, 1982, 46：554
[11] Rupnick MA et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1988, 24：435
[12] Ichikawa N et al. J Pharmacol Toxicol Methods, 1996, 36：45
[13] Scott PA et al. J Cell Sci, 1993, 105：269
[14] Domotor E et al. Neurochem Int, 1998, 33：473

上述所贴内容基本源自本人同名的article(已发表于<<细胞生物学杂志>>，2005，27：84-88)，请参考本人方法的站友自觉引用！
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 小中大
图1 大鼠脑微血管内皮细胞原代培养过程中的生长与形态变化
1.接种后当时，可见单枝状及多枝状脑微血管段，×100；
2.培养12 h后，可见内皮细胞从贴壁的微血管段游离长出，×100；
3.培养第4天，细胞不断增殖，呈短梭形，单层生长，×40；
4.培养第4天，同3，×100；
5.培养第7天，细胞单层达到融合，可见“旋涡状”分布，×40；
6.培养第7天，同5，×100。


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 小中大

图2 三种不同基质下内皮细胞的贴壁及生长情况
1.1%明胶涂布的培养皿接种后6 h，可见少量微血管段贴壁不牢，×100；
2.1%明胶涂布的培养皿接种后12 h，可见一些内皮细胞游离长出，×100；
3.鼠尾胶涂布的培养皿接种后6 h，可见少量微血管段贴壁不牢，×100；
4.鼠尾胶涂布的培养皿接种后12 h，可见一些内皮细胞游离长出，×100；
5.纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿接种后6 h，可见一些微血管段贴壁并有内皮细胞游离长出，×100；
6.纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿接种后12 h，可见大多数微血管段贴壁及内皮细胞游离长出，×100。


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 小中大
请求：偶要培养骨髓基质细胞，想请问各位大侠用什么最好得方法从大鼠骨髓中取基质细胞。我得体会：用DMEM冲洗骨髓腔后，用5ml以及1ml的注射器吹打数次。然后一只大鼠的双侧胫骨和股骨的骨髓细胞接种到2个75平方cm的培养瓶中，24后吸去培养液，用PBS洗3次或2次，再用胰蛋酶＋EDTA把细胞从壁上消化下来，再观察细胞的数量，结果发现细胞好少，而且单个贴壁的细胞几乎没有，只有少数成团的贴壁细胞（和其他细胞混合在一起，吹打时没被打散的细胞团）。理论上，细胞应该被吹打成单个，才更容易贴壁，这就和我们的实验结果有矛盾。我发觉，在吹打时，要把细胞吹打成单个，得需用较大得劲吹打，但是，所得细胞可能已不是活得。当你用较小得力吹打时，细胞团又很难打开，而且所得细胞里有好多得非基质细胞，大大影响了基质细胞得贴壁。我想用红细胞裂解液把红细胞裂解掉，再用胰酶把细胞消化成单个细胞，这样就可减少吹打次数和吹打劲，但我不知道红细胞裂解液对基质细胞是否有很大得影响。哪位高手能够给我指点一二？我要得细胞主要是基质细胞中得干细胞。再问一下，怎么样配红细胞裂解液？
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 小中大
谁会人的前脂肪细胞原代培养啊
还有可不可以把我师兄的大鼠前脂肪细胞培养写上来啊
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 小中大

大鼠胰岛细胞原代培养

一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞，
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 小中大

预定：淋巴细胞转化，脐带平滑肌细胞原代培养
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 小中大
视神经少突胶质细胞体外培养纯化及鉴定
1 材料和方法
1.1 DMEM/F12条件培养液（亚硒酸钠40μg·L-1，腐胺16.2 mg·L-1，转铁蛋白100 mg·L-1，胰岛素234U·L-1，甲状腺素0.4μg·L-1，黄体酮0.62 mg·L-1，谷氨酰胺3g·L-1）。DMEM/F12培养基、小牛血清购自Hyclone公司，兔抗鼠GC抗体、亚硒酸钠、腐胺等购自Sigma公司。
1.2 视神经胶质细胞的来源、培养 取新生2d的Wistar大鼠10只（第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物中心提供），无菌条件下取出双侧视神经。接种至24孔培养板内经多聚赖氨酸处理的盖玻片上。而后加入含30g·L-1小牛血清的DMEM/F12培养基，37(C，50mL·L-1 CO2，100%湿度连续培养3d。3d后弃废液，改为含5g·L-1小牛血清DMEM/F12条件培养液继续培养。每周换液2次。在获得足够的细胞数量后，改用无血清条件培养液继续培养，每2d换液一次。
1.3 形态学观察 每天在倒置显微镜（日本Olympus），观察培养细胞的生长过程和形态学变化并拍照。
1.4 免疫细胞化学鉴定：将含细胞盖玻片取出，0.01mol·L-1 PBS冲洗3次×5min；冷丙酮固定10 min；PBS冲洗（3次×5min）；30g·L-1过氧化氢室温孵育15min；PBS冲洗3次×5min；滴加正常山羊血清，室温孵育20 min；滴加1:100 GC抗体，阴性对照以PBS代替一抗，37(C孵育60min；PBS冲洗3次×5min；滴加生物素标记羊抗兔IgG，37(C，20min；PBS冲洗3次×5min；滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液；DAB工作液（武汉博士德公司）显色，自来水终止反应；脱水，透明，D·P·X封片保存。
2 结果
2.1 形态学观察结果
组织块24ｈ开始贴壁，48～72ｈ可见神经组织边缘游出少量细胞，主要为圆形或梭形（图1）。8～9d左右，细胞基本铺满培养孔。此时改用无血清条件培养基培养进行纯化。培养过程中，部分细胞死亡。12d左右获得的细胞胞体基本为呈圆形或多角型，直径约6～10μm。细胞核较大，胞质少（图2）。
2.2 免疫组织化学染色结果
培养的视神经少突胶质细胞的免疫组织化学染色GC蛋白阳性，未加一抗的呈阴性。染色结果显示成熟的少突胶质细胞突起丰富，互相形成蜘蛛网状（图3）。苏木素复染，异质细胞较少，90%以上为阳性细胞（图4）。

3 讨论
抑制神经再生基因Nogo的发现为视神经损伤的修复、视功能保护研究带来了希望。视神经胶质细胞包括星形胶质细胞和少突胶质细胞2种类型,分化不同,功能各异。成熟的少突胶质细胞不再具有分裂增殖能力，为分裂终期细胞[2]，培养较为困难。
1980年McCarthy[3]等建立了从脑灰质组织分离、纯化星形胶质细胞和少突胶质细胞的分离培养模型。目前国内外多采用该法[4]。利用少突胶质细胞和星形胶质细胞贴壁能力的不同采用振动分离法进行分离、培养。此法主要用来获取星形胶质细胞，获得的少突胶质细胞较少。存在着操作步骤多容易被污染、分离过程中因振荡离心易造成机械性损伤导致细胞死亡等缺点。
本实验采用视神经组织块培养的方法，对新生大鼠的视神经胶质细胞进行条件化原代培养，利用少突胶质细胞和星形胶质细胞生长条件的不同，采用条件培养基纯化2种细胞。少突胶质细胞和Ⅱ型星形胶质细胞是从一种普通双潜能的少突胶质细胞－2型星形胶质细胞祖细胞（oligodendrocyte-type-2astrocyte progenitor cell，O2A）发育而来[2]。大鼠出生后约1周，少突胶质细胞逐渐成熟。因此，从新生大鼠取材可获得O2A祖细胞。体外研究发现甲状腺素、胰岛素、转铁蛋白、腐胺、黄体酮和微量元素硒等，可使O2A祖细胞朝少突胶质细胞定向分化。而血清等可以诱导O2A祖细胞分化为Ⅱ型星形胶质细胞[2、5]。我们利用这一特点，逐步减少条件培养基中的血清浓度，促进O2A祖细胞向少突胶质细胞分化。最终采用无血清条件培养基，抑制星形胶质细胞及其它异质细胞增殖，而少突胶质细胞在此条件下则基本不受影响。GC是表达于少突胶质细胞膜以及髓鞘的一种主要类脂，它是识别少突胶质细胞普遍应用的特异性化学标志物[2、4]。免疫染色鉴定结果表明纯度较高超过90％。此方法简便、可靠、易于推广，便于对少突胶质细胞相关课题进行研究。
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