小中大【分享】质控菌种的管理规定
微生物实验用菌种是进行新产品研发和生产质量控制的标准物质。为了保证微生物实验的准确灵敏和人员及环境的卫生安全，特制定以下规定：
1. 菌种采集。实验室用菌种一是到国家法定机构采购，二是购买ATCC菌种(原代或国内传代)，三是科研中菌种交流。不管是哪种来源，均由公司统一采集。采集中严格按照规范执行。要求包装可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保证菌种合格和环境安全。采集中要有菌种传代标识。
2.菌种的活化：购买的标准菌种必须要求是冻干粉，科研中菌种交流可以为斜面或液体。
菌种的首次活化最好是在非选择性琼脂培养基上，除非特殊情况或特别推荐，一般不用液体培养基。具体使用培养基的情况如下表，详细菌种使用方法见附表：
方 法 培养基
方法1 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，非选择性羊血琼脂，PCA或营养琼脂，35℃正常环境培养24-48小时。
方法2 非选择性羊血琼脂，35℃正常环境培养24-48小时。
方法3 巧克力琼脂平板，35℃5-10%CO2环境培养24-48小时。
方法4 CDC厌氧血琼脂35℃厌氧培养48-72小时;部分专性厌氧菌能需要5-7天，才能充分生长;对于梭菌，以下新鲜培养基也可选用：营养琼脂，TSA琼脂，PCA琼脂，需培养48-96小时。
方法5 沙堡氏葡萄糖Emmons琼脂25-28℃培养3-7天;也可用PDA琼脂。
方法6 巧克力琼脂平板，35℃微需氧环境培养48-72小时。
方法7 改良罗氏琼脂或Middlebrook琼脂，35℃5-10%CO2或正常环境培养7天。
方法8 缓冲活性碳酵母提取物琼脂，35℃正常环境培养3-5天。
方法9 巧克力琼脂平板，35℃5-10%CO2环境培养48小时。
方法10 先用脑心浸出液肉汤或TSB培养基35℃增菌培养18-24小时，再划线至TSA琼脂35℃正常环境培养24-48小时。
方法11 先接种于MRS肉汤35℃增菌培养24-48小时，再划线接种至含羊血的哥伦比亚CNA培养基35℃5%CO2环境培养24-48小时。
方法12 PDA琼脂45℃正常环境培养48-72小时。
方法13 先接种于10B精氨酸肉汤，作系列梯度稀释35℃正常培养至培养基变成粉红色，接入A-8琼脂。
3.菌种保存。所有菌种均由实验室专人(双人双锁)保存于专用冰箱或其它保存方式。要建立菌种登记台帐，详细记录菌种采集、保管、制备、使用、处置情况;每一种菌种一定要有本公司的检测鉴定报告(具体的的鉴定方法见ATCC提供的菌种证书方法);具体菌种保存方法如下：
3.1 干粉菌种：购买的干粉菌种保存于2-8℃冰箱中，可保存3-5年。
3.2 斜面菌种或液体菌种：
3.2.1 液氮罐保存方法：用于第一代菌种的长期保存，每种菌种保存5管。
(1)准备用于液氮保藏的安瓿管或菌种保存管(塑料)，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液体的。
(2)加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞， 121℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用121℃灭菌15分钟。
(3)接入菌种：将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管;霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。
(4)冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。
(5)保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。
(6)恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。
3.2.2 液体石蜡保存法：将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎， 121℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存(有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长)。
1) 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌属、沙门氏菌属、副伤寒沙门氏菌、李斯特氏菌属、蜡样芽胞杆菌、八叠球菌、短芽孢杆菌、大肠杆菌HB101、大肠杆菌DH5a、猪肺疫、禽多杀性巴氏杆菌(禽霍乱)、猪丹毒、大肠杆菌O157、大肠菌群、产气肠杆菌、志贺氏菌属;接种于半固体培养基上，36±1℃培养 18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。
注：副溶血性弧菌接种于含盐的半固体培养基上，36±1℃培养18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于室温。
2)产气荚膜梭菌、梭杆菌属、拟杆菌属等厌氧菌、厌氧消化链球菌：接种于CDC厌氧菌琼脂中，培养18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。
3)酵母菌：接种于YPD培养基中，28℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。
4)霉菌、白色念珠球菌：接种于PDA培养基中，28℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。
5)链球菌属：接种于羊血琼脂，36±1℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。
6)副嗜血杆菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2环境)、脑膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2环境)、流感嗜血杆菌接种于巧克力琼脂，36±1℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。
7)分枝杆菌属：接种于改良罗氏琼脂或Middlebrook琼脂36±1℃培养7天，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。
