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标题:[求助]如何提取细胞的上清？

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发表于 2012-9-4 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我的确是检测细胞处理后分泌的蛋白质的活性，主要是用酶谱法检测基质金属蛋白酶的活性，我想知道的是细胞上清，指的是用无血清的培养基处理细胞24小时后，直接吸出培养基，离心除去死细胞以及碎片后的成分就是上清吗？但是这种情况下要加多少无血清的培养基呢？我所要检测的蛋白的浓度和这关系很大，如果量多的话，那得到的上清也多，但是蛋白的浓度也许不太大，一般说来，癌细胞分泌的MMP的浓度比较大，我没有检测过浓度，所以还不确定要不要浓度样品。我想知道上清的确切的来源？非常感谢帮助！

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发表于 2012-9-4 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
怎么处理药物以及作用时间取决于你要做的实验，最好查权威文献支持，我们也可以多交流！
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发表于 2012-9-4 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
离心除去死细胞以及碎片后的成分就是上清。
显然是不能够通过蛋白定量来确定的。
最简单的方法就是严格控制你是实验条件，即细胞接种密度一致，处理药物量一致，处理的时候加的培养基也要一致。这样最后离心上清后，取等体积的上清进行实验。
另外，你可以参考文献做法。一般文献都会讲的。如果要做绝对含量，可能类似ELISA，还需要搞到他的纯化蛋白，做标准曲线。然后根据你的等体积后测量出来的值，换算成绝对含量值。
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 小中大
你的建议非常有道理，但是我还有些不太明白，就是你说不能通过蛋白定量来确定，但是如果不进行蛋白定量的话，那上样的时候每个孔 的蛋白的上样量不一样，跑出来的带有可比性吗？在做western的时候不是要保证每个上样孔的蛋白总量是一样的吗，那跑出来的带的大小，深浅就说明目的蛋白的含量的差异造成的。当然我暂时先不做western，先做酶谱法检测MMP的活性。我很困惑，希望能得到大家的帮助啊！
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发表于 2012-9-4 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还希望大家多多帮助啊！
马上要做实验了，请大家多指导！
如果先用无血清培养基处理细胞后，再用药物干预的时候是用有血清的培养基还是用无血清的培养基呢？
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发表于 2012-9-4 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实这个问题很简单。你收集细胞上清的目的是要测定上清中蛋白的活性。你依然可采用常规蛋白的一些方法。其中稍微改变就行了
1、收集细胞上清，可通过透析浓缩或者PEG6000沉淀浓缩，因为你的蛋白含量肯定低，所以第一步是要富集蛋白，便于纯化收集。
2、当浓缩后，就是纯化蛋白，可通过柱层析纯化，或硫酸铵沉淀纯化，以前者较好。
3、检测活性。
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发表于 2012-9-4 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的建议非常有道理，但是我还有些不太明白，就是你说不能通过蛋白定量来确定，但是如果不进行蛋白定量的话，那上样的时候每个孔 的蛋白的上样量不一样，跑出来的带有可比性吗？在做western的时候不是要保证每个上样孔的蛋白总量是一样的吗，那跑出来的带的大小，深浅就说明目的蛋白的含量的差异造成的。当然我暂时先不做western，先做酶谱法检测MMP的活性。我很困惑，希望能得到大家的帮助啊！

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因为正常无血清培养的正常细胞上清,基本是没有蛋白的.如果要蛋白定量,你的上多大体积的样才能保证与处理组相同蛋白量.因此,较为科学的方法就是等体积检测.
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园丁##[使用道具]
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 小中大
还希望大家多多帮助啊！
马上要做实验了，请大家多指导！
如果先用无血清培养基处理细胞后，再用药物干预的时候是用有血清的培养基还是用无血清的培养基呢？

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应该还是无血清培养基
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mamamiya[使用道具]
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 小中大
我想请教大家，我的细胞是杂交瘤细胞，我要提取细胞上清抗体的含量，能使用huangxb010 说的方法吗？
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mamamiya[使用道具]
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 小中大

其实这个问题很简单。你收集细胞上清的目的是要测定上清中蛋白的活性。你依然可采用常规蛋白的一些方法。其中稍微改变就行了
1、收集细胞上清，可通过透析浓缩或者PEG6000沉淀浓缩，因为你的蛋白含量肯定低，所以第一步是要富集蛋白，便于纯化收集。
2、当浓缩后，就是纯化蛋白，可通过柱层析纯化，或硫酸铵沉淀纯化，以前者较好。
3、检测活性。
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