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标题:[求助]尼氏染色鉴定海马神经元

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这说明我培养的神经元细胞几乎没有成活。能否再介绍一些成功培养神经元细胞的经验呢?
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神经元是非常娇气的细胞,对分离的条件培养基要求非常苛刻,但是一旦成功培养,可生长长达一个月。个人认为培养神经元要注意:
1 剥膜一定要干净,要在解剖镜下仔细剥干净
2 一定要用poly-L- lysine 铺板,使神经元更好的帖壁
3 使用进口的胎牛和马血清
4 培养基的PH 值很关键,我个人培养过数种不同类型的细胞,发现神经元是最脆弱的细胞,尽管其培养过程不是很复杂,所以一定要调节好试剂的PH 值,包括胰酶的酸碱度。宁可偏酸一些也不要偏碱。
5 园子里在图片仓库里贴的神经元的照片非常漂亮,神经元的立体感很强,你可看看。
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那培养基和胰酶的PH是多少最合适呢?我现在用PH试纸调的是7.0左右,是否合适?

我用的种植培养基是:10%胎牛血清,10%马血清,1%双抗,1%谷氨酰胺,加入DMEM/F12 至100ml。
24h贴壁后换维持培养液:
5%马血清,1%双抗,1%谷氨酰胺,加入DMEM/F12 至100ml
胎牛血清是国产的。是否合适?
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是这样的,我们配培养液时PH 值一般都是在 7.2左右,但是液体在放置一段时间后可能变碱,这可以从颜色上看出来。
我们是在24h 后换用B27无血清培养基(Gibcol)。
国产的胎牛恐怕不太好,建议用Gibcol或者Hyclone的血清。
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请再帮我看看这张照片是不是海马神经元,谢谢!


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很遗憾,这两张图所染的都不是神经元。
尼氏染色所染的是细胞浆内的粗面内质网和核糖体这些嗜碱性物质。神经元只有胞浆染色,核不着色,呈空泡状。你仔细看我的那张图片可以隐约看到浅染的部位,即细胞核,放大倍数后可清楚看到细胞的核仁。
而你的照片深染的却是细胞核,看起来像是成纤维细胞。肯定不是神经元了!
另外,要提醒你的是如果你要鉴定神经元,最好用NSE免疫组化法,尼氏染色特异性不强。
还有一点,当神经元长到十天左右,其突起很长而且比较多,交错形成网络,肉眼即可鉴定。
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我也是养海马神经元的,之前养的还行,但不知为什么节后细胞一直生长不好,贴壁细胞数量少,不知什么原因?还请高手指点啊,多谢了!
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我在取材时,感觉剥膜不是很干净,除了技术原因也有实验条件的原因吧, llljjj上次说的 成纤维细胞污染 是不是指如果剥膜不干净,成纤维细胞会长的很多,而影响神经元细胞的生长,甚至使神经元细胞死亡呢?正如我上面所照的照片及我在镜下所看到的:几乎没有神经元细胞?
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kulee[使用道具]
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成纤维细胞生长的原因就是剥膜不干净所致。最好选择在解剖镜下剥膜,这中间存在一个技术性的问题,需要熟练。
可以加阿糖庖苷抑制细胞的分裂生长,包括神经胶质细胞和成纤维细胞。
成纤维细胞的增殖太快了,肯定会影响神经元生长的。
4月27号发的第四张照片可以看到神经元,其他的就不好说了。
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