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标题:【讨论.精华帖.】细胞培养专区

bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-9-16 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

293是半贴壁细胞中较靠近贴壁的一种，所以ATCC建议胰酶消化，但不用胰酶也可以吹打下来。293细胞状态好不好主要看细胞是否清亮等等。但我自己的感觉好象是状态好的293贴壁紧。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-9-16 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞培养：RPMI-1640培养基如果标签上已经注明"with L-glutamine"，还要不要添加谷氨酰胺？添加量多少？象这种已含有L-glutamine的1640，其L-glutamine的浓度是多少？
再进一步，一般细胞（肿瘤细胞如S180，B16等）的培养需要谷氨酰胺的浓度应该是多少？
谢谢！

————————————————————————————————————————————————————————————————

  注明了“with L-glutamine”的培养基就不需要再加谷氨酰胺了，已含有L-glutamine的1640中L-glutamine浓度为2mM/L，其它细胞的培养就得看它们各自培养基是什么了，因为不同培养基其L-glutamine浓度也有差异，详细请见cuturl('http://www.atcc.org/Products/ClassicMedia.cfm')
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发表于 2012-9-16 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
293细胞用酶消化很容易下来，但是吹成单细胞却有点麻烦。各位能不能帮我指出问题出在什么地方。请问yong主任单纯吹下来的293细胞容不容易成单细胞形态？
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发表于 2012-9-16 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

吹打下来的细胞分散得没有消化的细胞分散好。
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-9-16 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用的胰酶加edta吗？胰酶浓度是多少，我在atcc上看到是0.25％，这里好像有朋友推荐0.05％，我依此浓度消化，效果很差。
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chuntian1983[使用道具]
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发表于 2012-9-16 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
293细胞用酶消化很容易下来，但是吹成单细胞却有点麻烦。各位能不能帮我指出问题出在什么地方。请问yong主任单纯吹下来的293细胞容不容易成单细胞形态？

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消化时最好放入培养箱，在37℃时酶的活性最高，再加以仔细吹打（注意：吹打一定要有顺序，瓶底朝上，不要遗漏任何一个角落），应该没什么问题。有一次我养的一种细胞放在培养箱消化过久，导致细胞全部脱落到酶液中去了，麻烦得很。单纯吹下来的细胞一般不太容易形成单细胞形态。特别是密度很大或汇合了的细胞传代，不太可能会是单细胞。
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发表于 2012-9-16 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我使用的胰酶浓度是0.125%，调PH可以用NaOH，也可以用NaHCO3，带酚红的胰酶调至紫红色消化能力强。消化温度也重要，可以用手加热细胞面，难消化的细胞也可以放入温箱。胰酶加入前，细胞最好用无血清的培养基或PBS洗一遍。如果胰酶效果好，胰酶加入后稍浸泡就倒掉，残存在瓶内的量足够消化彻底。
293贴瓶不紧，需要的消化较温和，一定要防止过消化。消化至细胞面看上去出现绒毛感较好，此时细胞形态已经变圆。如果消化的细胞随瓶流淌则消化过头了，这种细胞已经受伤，不好培养。
EDTA浓度我不记得了，你查书吧，EDTA的量增加一点也可以加速消化。
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发表于 2012-9-16 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近养HEK293摸出了一点小经验，大家不妨一试。首先解决贴壁问题，可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿，方法是将明胶加入培养皿，使之浸泡到底面的各个部分，然后吸出，置超净台内晾干即可使用。这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。当然了，若是新的塑料培养瓶就不用处理了，玻璃瓶我看还是下点功夫的好。第二是传代问题，细胞在达70~80%密度时就进行传代，传代时将欲传细胞从培养箱内取出，垂直放置5分钟，然后在瓶内加入等体积的预温至37度左右的培养液，充分吹打并1：1分瓶。在该过程中不一定非要吹成单细胞悬液，只要没有大的细胞团就行了。这样传代就是有点累，每24小时一次，不过伺候好了，细胞挺争气，分瓶后很少看到浮着的死细胞。
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yychen[使用道具]
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发表于 2012-9-16 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我不赞成反复使用一次性细胞培养器具，极难洗干净的。我曾经试验过反复使用，效果不理想。

推荐便宜的细胞培养耗材，比利时Orange和以色列Miniplast。二者的质量毫不比Corning、Facol的差，价格只有前者的1/2-3/5。我个人认为，Orange的培养瓶比Nunc公司的效果还好呢！
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发表于 2012-9-16 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

污染问题
刚刚开始培养细胞，是成纤维细胞，用DMEM+10%FCS，最近发现细胞总被污染，培养液中漂浮着一团团死细胞壮的东西（不敢肯定是死细胞还是细菌），时间长了会增多，但不见运动（听说细菌是能见运动的），很着急不知该如何控制，我试着用新洁而灭查过，不见好转，不知是什么原因，恳请指点。
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