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标题:【求助】从大鼠胸主动脉取平滑肌细胞如何操作？

hyuu[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
搞不好,培养出的是成纤维细胞
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bongte[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在培养细胞的过程中，贴壁法和消化法我都尝试过，我个人觉得就操作上来说，后者更方便点。
我曾使用贴壁法培养过内皮细胞，处理血管时一定要小心去除外膜，尽量剪除血管上附着的纤维和粘膜，然后用锋利的刀片（最好是新的）将血管切成1毫米大小的组织块，我觉得外膜上粘连的纤维的处理最关键，因为我在其后的培养过程中发现凡是组织块周围没有粘连物的，细胞很容易爬出来，不知道是什么原因，我也不知道在平滑肌细胞贴壁培养的过程中是否也有这种情况，仅供参考！
  一般来说平滑肌细胞相对要好养点，胰酶和胶原酶我都尝试过，而且都有成功的经验，因为我是做组织工程的，在用消化法获得内皮细胞后，将无内皮细胞的血管的外膜用血管钳撕掉，剩下中膜层，用剪刀剪成很小的组织块1-2毫米，具体大小不限，但越小越好，这样后期消化容易些，然后将这些组织块放入胰酶或胶原酶中，在这过程中我觉得最关键的是，调节消化液的PH值，可以跳得稍微偏碱点，尤其是胶原酶，它的作用缓慢而持久，越到消化终末，速度越快，消化液明显偏酸，对细胞生长不利。在消化的过程中要不时地摇晃，以达到均匀消化的目的。消化的时间大约需要6个小时左右，消化液呈混浊状，仍有细小的组织块，但千万不能消化过头，不能消化到看不见组织块。消化后期你小心点就可以了。然后将这消化液离心洗洗，一古脑全倒在培养瓶中，玻璃的也行，培养48-72小时，换液你就会有惊人的发现了！
以上是个人做试验一点经验，远多多交流
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
昨天做了一次酶消化法。
用的是胶原酶2消化中膜。
消化时一直担心酶消化过头损伤细胞膜，所以总共胶原酶在37度培养箱里消化的时间大约30分钟，中膜碎片剪的都在1平方毫米以下，消化后上清夜没有出现浑浊的情况，好像肉眼观察还是比较清亮的溶液。离心后50ml离心管底部仅有少量细胞，培养24个小时后显微镜下见到的细胞数量相当有限，大约一个视野里仅3-4个细胞。
本人操作中总担心消化过头，是否对于中膜组织而言，消化应该充分一些。

还有消化后的组织块离心前需要过滤一下的吧
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TNT[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、用的是胶原酶2，无血清培养基配成0.2%（但我用的时候都略略低于这个浓度，大概0.18%）。
2、在血清瓶里将组织剪成1-2mm小块后，加入配好的酶。封好口。
3、37度空气摇床上15rpm震摇6-8小时。掌握的度基本与wuffly所说的一致，即消化液略呈混浊状，仍有细小的组织块。如果都变成胶冻状，没有组织块，那么一定消化过头了。
4、滤网过滤，滤液1000rpm离心7min×2次。

如果你的消化液是清亮的，而且细胞数很少，我觉得是消化的时间不够。
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
培养两天后观察，好像细胞多了几个，有个问题想问，在细胞融合前，平滑肌细胞是否就呈梭形的，我现在在一个视野下可以见到大概十来个细胞，不过都是圆形，请问现在能否确定这是否是平滑肌细胞？
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TNT[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
融合前是梭形的，带着长尾巴。
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看来我得重来一把了，48小时后，细胞多了不少估计一个视野下可以见几十个，不过细胞都是圆形的。

各位给我说说这可能是什么细胞？
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