【求助】单克隆挑不出怎么办

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标题:【求助】单克隆挑不出怎么办

tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用293细胞做转染，转染已经成功了，测过活性还可以，现在在用有限稀释法挑单克隆，但按书上的方法挑了三次都没有成功，就是将细胞稀释到10000个/ml，然后再稀释10倍，再稀释10倍，直到10个/ml，将稀释的细胞液以每孔100微升加到96孔板，但我让它长了20天都没长起来。不知道有什么技巧，请大家给点意见。

biabiade[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你确定每孔1-2个细胞了吗？分完孔当然要在镜下确认每孔的细胞。

如果有细胞长不起来，有可能是折腾时间太久，细胞状态不好了。
细胞还贴壁吗？如果贴壁接换回液。

单克隆化没什么技巧。

TAT[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是这样做有限稀释的：

单克隆荧光阳性细胞的挑选：荧光蛋白标记的细胞以荧光倒置显微镜和FACS检测荧光细胞百分比，必要时重复转染一次，有限稀释法获得荧光阳性单克隆：于96孔板中8孔为一组，每组除第一孔外其余7孔每孔加入含15%FBS的IMDM50uL（无刻度巴斯德滴管1滴），第1孔中加入100uL细胞密度为1000个/mL的含15%FBS的IMDM，即100个/孔，（以排枪）自第1孔中吸取50ul，以后每孔依次做2：1倍比稀释，丢弃最后1孔中吸出的50uL，常规培养数天~1周后于荧光显微镜下挑选eGFP＋单克隆并扩增。

这个方法可以确保一定有细胞生长，如果比例足够，96孔板中至少有12~24个孔是有1个到2个细胞的，一般会有阳性孔。这种方法起始细胞数可以比较灵活，适合懒人。不象上面提及的经典方法，算得人头晕。我也没有去对过文献，自己想的。

我想，也许这种做法同样可以体现“有限稀释”的本意。

只要阳性率足够，不难。我是用逆转录病毒转的。

不知各位以为如何？

园丁##[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上自创的有限稀释法很好,理论上好象可以,而且是很聪明的方法,我马上就试一下,一周后就知道结果了.

乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的是整排的有限稀释，

第一排约50cell/100ul/孔
第二排是第一排的一半
直至第十二排，
每次做两板。

这个方法好像2-3个月前在本版说过，
讨论的是真核表达的问题。

二子[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一位在某国做过多年实验的老师，介绍给我如下方法进行单克隆化，他一直使用此法，效果很好，我正在准备试试，现介绍给各位：

将玻璃吸管在酒精灯下烧至熔化,然后两头拉伸并折断一部分使其成为毛细管,在管的另一头套上一个胶管含于口中。此时准备好96孔板，并加上培养液。
在荧光显微镜下观察－选定细胞－将吸管置于细胞上－轻轻吸细胞（在镜下可看到细胞进入了吸管）－将细胞转到96板中。如此操作，选上20～30个细胞培养。然后再选择最亮的含荧光的细胞继续培养。
在此操作中：
（1）最好有一个助手帮忙，主要是在你吸到细胞后，帮助你将96孔板打开；
（2）对于无菌操作，不用太担心，只要每一步都注意一些，不会污染；

如果感兴趣可以试一试，然后在此交流一些操作上的心得，如何！

caihong[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用楼上改进的有限稀释法挑了单克隆了,细胞是有了,不过好象没有贴壁,大概是要等两天吧,很有创意的方法,多谢!多谢!

caihong[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上兄的方法好象和卢圣栋老先生编写的一本书的配套光盘中转基因小鼠的制备异曲同工。有这个光盘或能借到的，可以看看，以供参考。

caihong[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

已经挑了四五天了,细胞还是没有生长的迹象,即使是在一孔有十几个细胞的孔中,也没有长起来,是时间不够长,还是有其他问题呢?
在挑单克隆的时候我大概总共用了半个小时不到的时间,从用胰酶消化细胞到最后放入孵箱,应该不会太长吧,在筛选稳定细胞株时我用的是800微克/毫升的G418浓度,是否在挑单克隆的时候应该减少呢?
96孔板是greiner bio-one的,用的是10%的胎牛血清,平时用它们做检测,细胞密度用20000个/孔铺板时,细胞的生长都很好的呀,应该不是这方面的问题才对.
本应该是很简单的问题,可就是挑不出来,真的很郁闷,不知道大家是否可以多点意见?

langlang[使用道具]
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发表于 2012-9-29 11:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

卢圣栋老先生的配套光盘倒是有两盘，当时是从录像带翻录的。现在好像是12本都有光盘了，不过我还没有见到全套。"海淀图书城“昊海楼404室有卖的。人民卫生出版社出版。
北京的朋友感兴趣可以问问：
Tel：82872132；Fax:62534434

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