液相色谱

被测多肽中有赖氨酸，是一个甲磺酸钠盐

回复 #1 悠悠白云 的帖子
走梯度的问题
我想走一个pH梯度，在pH3时，不出峰，在pH2.5时死时间出峰，为什么走线性梯度pH3-2（10min）中间不出峰？

回复 #5 悠悠白云 的帖子
缓冲液从2.5～3.0改变这么大，为什么不可能啊？我走的是线性梯度，mp：A1:磷酸氢二钠（10mM,pH=3),A2:磷酸氢二钠（10mM, pH=2) B;乙腈，A/B=60/40, gradient：10min内，由A1/B=60/40变为A2/B=60/40.大家看看有什么不妥吗？

pH gradient HPLC来分离某些复杂体系，这种思路可以试验。
按楼主设定的pH gradient 运行样品，不出峰，很正常！楼主虽然注意到了流动相洗脱体系中有机相比例保持不变，但确忽略了一个事实：使用的是磷酸氢二钠buffer，“A1:磷酸氢二钠（10mM,pH=3),A2:磷酸氢二钠（10mM, pH=2) B;乙腈，A/B=60/40, gradient：10min内，由A1/B=60/40变为A2/B=60/40.”在这个线性梯度过程中，流动相体系没有达到楼主预想的从pH 3 梯度变化到 pH 2！因为磷酸盐buffer有一定的缓冲容量的，pH没法变过来。楼主若是不相信的话，可以从HPLC废液口，于不同时间点接流出液，测定pH。或者更干脆的方法——直接把 A1/B=60/40 和 A2/B=60/40混起来，测pH。

给楼主的建议：

既然分离的化合物是多肽类，建议采用TFA体系，同时考虑到运用pH gradient HPLC方法，所以可尝试：
mobile phase：A1:0.01%TFA水溶液（V/V，pH=2.84)，A2:0.10%TFA水溶液（V/V，pH=2.03) B;乙腈，A/B=60/40, gradient：10min内，由A1/B=60/40变为A2/B=60/40
试试这个体系，看是什么情况？
Effects of TFA Concentrations on HPLC


另外，pH gradient HPLC法分离多肽，可以参考一下相关文献。
pH gradient reversed-phase liquid chromatography as a fractionation tool for the separation of peptides
cuturl('http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6THP-4PYYTNG-1&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=2cab8269d63d53b9a610291caf9fbf6f')

[ 本帖最后由 aa_tang 于 2009-7-22 20:39 编辑 ]

非常感谢您的建议，您说的这个体系试过了，没什么效果。此肽盐我们在高效毛细管电泳上试过了，可以得到分离，只是峰形不太好，但重现性还可以。我想是不是需要外加电压才可以，液相会不会不适合分离呢？

觉得很奇怪，而且采用TFA体系也不行的话。
建议可以先试等度，从2.0~3.0逐渐变化，每次0.1，找出开始不出峰的PH值，或保留时间随PH的变化规律。
另外，从你的化合物入手，看你的多肽是否发生了质的变化而引起检测上的变化。

太感动了！谢谢各位指点！我把各位的建议都试试，有结果了告诉大家！

看了您的问题，和看了大家的解释。我个人是这么理解的。因为不清楚具体目标和过程只有如下看法：
1 你的梯度系统过于复杂，B相是固定的，为何不和A1，A2整合一下，这样你的溶剂压缩波动会减少很多，因为按你的字面含义，属于3溶剂系统，这在一般梯度中应该避免的，原因是溶剂压缩比，溶液混合后pH改变等，常规液相不是能很好的进行，超高压液相可能是一个解决途径；
2 溶液混合后，特别是和有机溶剂混合，pH值通过水相电极测定只是一个表观值，具体的在梯度过程中的实测值，您并不清楚，所以这也是一个原因，同时也是建议您减少溶剂系统的原因之一；
3 您分析的是多肽，也有标准品，序列是明确的，开始您计算的pI是多少，其中碱性，酸性氨基酸比例是多少，总体应该根据这个进行溶剂选择。这里提供一个蛋白组中常用的溶剂系统，你可以简单测评一下，A 97%water：3%ACN—B 10%water：90%ACN，两相均加入0.1%formic Acid.
4 您提出的实验现象在大体积进样中常出现，pH3没有峰，是因为在记录之前就已经洗脱出去了，这个原因有2，一个是在进样过程中，loop体积较大，进样时间大于溶剂前端流动到柱的时间，这时候在记录开始时，溶质已经冲出柱子，第二是样品溶解溶剂，将柱子quench了，也就是不保留了。
5 关于梯度，实际上在液相洗脱相关的各个因素中，溶剂比例浓度，温度，添加剂比例，检测条件等等，均可以尝试梯度改变来达到分离目的，因此看到上面一些叙述，有的过于局限，梯度不是一个限定词，而是一个因素改变策略。
以上只是建议，具体还要看你的实验过程和对象。

谢谢您的热心帮助，用三相是为了节省乙腈，呵呵。

这个问题看来很复杂？
注意一点，流动相的pH梯度不等于实际的pH梯度，二者有差异的，尤其是有有机溶剂参与时。
0.5的pH变化会造成这么大的差异？？？请具体提供化合物的结构。

真是不好意思，对于该肽盐我只能说这么多，甲磺酸钠肽盐，等电点2.5（不知道是不是可靠，呵呵）我想最有可能的就是跟该物质的结构有关系。总之，用什么流动相不是不出就是死时间出，走浓度梯度也不出。

回复：悠悠白云

呵呵，没见过你做试验的这种方式，两种流动相体系改变做梯度！真不明白你想通过这样的梯度，想获得什么信息？是想获得最佳的pH值，还是选择一种适用的缓冲液！你这种做法，是浪费时间了！
最好每次只改变一个因素，比如你要选择pH, 要用同一个缓冲盐溶液，其他色谱条件一样，配置3不同的pH值进行试验，看看色谱峰的移动情况，选出最佳的pH。若选择不同的缓冲盐，在确定的PH值下，试验不同缓冲盐种类对分离的影响！你的方法是自己开发的，还是标准的方法！如果是自己开发方法，你的重新进行试验。如果是人家提供的标准方法，我就无语了！