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健康Ｗｉｓｔａｒ大鼠,断颈法处死Ｗｉｓ ｔａｒ大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100ｕ/ｍｌ,链霉素100ｍｇ/ｍｌ的无菌生理盐水中。每次取材2～3只大鼠。贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2～3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1ｍｍ×1ｍｍ大小的组织块。并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5ｃｍ。盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2～4ｈ使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3～5ｄ。待有细胞从组织块周围游出后换液。
原代培养动脉ＶＳＭＣ的传代培养 当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1～2ｍｉｎ,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3～4ｍｌ终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。将细胞悬液一分为二接种到新的培养瓶中,补足培养液(每瓶3～4ｍｌ)。未消失的组织块会随细胞换液、传代而除去。
