生化反应和生化分离

一、目的
学习纤维素薄层层析的操作方法，掌握分配层析的原理。
二、原理
以纤维素作为支持物，把它均匀地涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析即为纤维素薄层层析。纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在纤维素上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。
三、实验材料、仪器和试剂
1．实验材料
绿豆芽或萌发小麦种子
2．仪器
烧杯50mL×1；玻璃板5 cm×20cm×1；层析缸；毛细管；喷雾器；研钵。
3．试剂
标准氨基酸溶液：丝氨酸、色氨酸、亮氨酸，分别以0.01mol/L 盐酸配成4mg/mL 的溶液。
纤维素粉（层析用）或微晶型纤维素（层析用）；羧甲基纤维素钠（CMC）。层析溶剂系统：正丁醇（分析纯）﹕冰醋酸（分析纯）﹕水＝4﹕1﹕1（V/V）。显色剂：0.1％茚三酮-丙酮溶液。
四、操作步骤
1．氨基酸的提取
取已萌发好的小麦种子2g（或绿豆芽下胚轴2g），放入研钵中，加95％乙醇4mL 及少量的石英砂，研成匀浆后，倒入离心管中离心3 000r/min、15min，上清液即为氨基酸提取液，用滴管小心吸入点样瓶中备用。
2．制板
取少量羧甲基纤维素钠（约12mg），置研钵中充分研磨，再称取纤维素粉3g 于研钵中研磨，再加入14mL 水研磨匀浆，把纤维素匀浆倒在洗净烘干的玻璃板上，轻轻震动，使纤维素均匀分布在玻璃板上，水平放置风干，用前放入100～110℃烘箱中活化30min。此处羧甲基纤维素钠是起粘合剂作用，它使纤维素粉能较牢固地粘附于玻璃板上，加入量过多会破坏纤维素薄层的毛细作用而使层析速度延缓，加的量过少则粘合不牢固，因此需要注意加量控制。
3．点样
用刀片将薄层板上薄层的左右各边刮削掉0.5cm，以防止“边缘效应”。在纤维素薄板上距一端15mm 处，用铅笔轻轻划出点样记号。样点之间距离1.3cm。用毛细管吸取样品，在记号处点样，样品斑点直径控制在2mm 左右。
4．展层
将薄板有样品的一端浸入已存放展层溶剂的层析缸中，层析溶剂液面不能高于样品线。待展层溶剂走到距薄板顶端0.5～1cm 时取出此薄板（约1～2h），用铅笔在前沿处作一记号后用电吹风吹干。
5．显色
将茚三酮显色剂喷雾在板上，用热吹风吹数分钟，（或置于70～80℃烘箱中烘干）即可观察到紫红色的氨基酸斑点，脯氨酸例外，为黄色斑点。用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸的Rf 值。Rf 值为迁移率（rate of flow, Rf），在恒定条件下，每种氨基酸有其一定的Rf 值。
根据已知标准氨基酸和Rf 值，与小麦（或绿豆芽）提取液中氨基酸的Rf 值比较，确定提取液中含有哪些种氨基酸。
五、附 注
1．在操作过程中，手必须洗净，只能接触薄板上层边角；不能对着薄板说话，以防唾液掉在板上。
2．配制展层剂时，要用纯溶剂，应现用现配，以免放置过久其成分发生变化（酯化）。
六、思考题
1．什么是分配系数？
2．薄层层析中极性氨基酸与非极性氨基酸展层的速度哪个快一些？
3．何为“边缘效应”？如何减轻或消除？
叁考答案
1．分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值。在层析条件确定后分配系数是一常数，以K 表示
分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力的影响。所以不同物质的分配系数不同。而在恒温恒压条件下，某物质在确定的层析系统中的分配系数为一常数。
2．层析的分离是基于氨基酸的非极性性质。物质的极性越小（即非极性越大），在有机溶剂中分配就越多，迁移率就越大；反之物质的极性越大，迁移率越小。所以非极性氨基酸在有机溶剂中展层的速度快于极性氨基酸。
3．在用多元系统进行展层时，其中极性较弱的和沸点较低的溶剂（例如氯仿-甲醇系统中的氯仿）在薄层板的两边易挥发，因此，它们在薄层两边的浓度比在中部的浓度小，也就是说在薄层的两边比中部含有更多的极性较大或沸点较高的溶剂，于是位于薄层两边的Rf 值要比中间的高，即所谓“边缘效应”。为减轻或消除边缘效应，可在层析缸的内壁贴上浸湿了展开剂的滤纸，使层析缸内溶剂蒸汽的饱和程度增加。

[ 本帖最后由 射雕英雄 于 2009-8-4 16:48 编辑 ]