生化反应和生化分离

一、实验目的
1.了解凝胶层析的基本原理。
2.掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的实验技能。
二、实验原理
凝胶层析(gel chromatography)是20世纪60年代发展起来的一种分离分析方法。其法有许多同义词如凝胶过滤、分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析等。
凝胶层析是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。凝胶的孔隙犹如”筛眼”，当被分离的物质流过凝胶柱时，分子大于凝胶”筛眼”范围的物质完全被排阻，不能进入凝胶颗粒内部，只能随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此受到的阻滞作用小，流程短，流速块儿先流出层析柱；分子小于”筛眼”的物质则可完全深入凝胶颗粒的”筛眼”中。因此受到的阻滞作用大，而且从一个颗粒的”筛眼”又进入另一个颗粒的”筛眼”，其流程长，流速也就慢，从层析柱中流出就较晚。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。从流出先后次序的不同即可达到分离和纯化被分离物质的目的。
凝胶的这种特性又称为分子筛效应，洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。
在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积称为外水体积V0，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V0时，出现洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积成为内水体积Vi，能全部透入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V0+Vi 时，出现洗脱峰。
将分子筛分配系数定义为：
K= Ve / Vi
若生物大分子的分子为球形，其K 与生物大分子的相对分子质量间存在如下关系：
K = －lgMr + c
其中b 和c 为常数。试验已证实这一关系的存在(排阻体积与相对分子质量的关系)。目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，其中最常用的是葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质量大小的物质。本实验用葡聚糖SephadexG—75分离胰岛素(Mr 为6000)和牛血清白蛋白(Mr 为75000)。
三、仪器和试剂
仪器
层析柱1cm×90cm、恒流泵、紫外检测仪、部分收集器、记录仪、试管、玻璃棒。
试剂
1. 待分离样品：胰岛素、牛血清白蛋白。
2. 蓝色葡聚糖-2000
3. 葡聚糖Sephadex G—75
4. 洗脱剂
四、 实验步骤
1.凝胶的处理
葡聚糖SephadexG-75干粉经蒸馏水室温充分溶胀24h，或沸水浴中3h，这样可大大缩短溶胀时间，而且还可杀死细菌和排除凝胶内部的旗袍。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。凝胶颗粒要求大小均匀，可是流速稳定。凝胶充分溶胀后用倾泌法可将不易沉下的较细颗粒除去。将溶胀后的凝胶抽干，用10倍体积的洗脱液处理约1h，搅拌后继续用该法除去悬浮的较细颗粒。
2.装柱
将层析柱垂直装好，关闭出口，加入洗脱液约1cm 高。将处理好的凝胶用等体积的洗脱剂搅成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝胶沉积约1cm 高时，再打开出口，继续加入凝胶浆，只凝胶沉积至一定高度(约70cm)即可。装柱要求连续，均匀，无气泡，无”纹路”。
3.平衡
将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2～3倍床体积的洗脱剂平衡，流速为0.5mL/min。平衡好后在凝胶表面放一片滤纸，以防加样时凝胶被冲起。
柱装好和平衡后可用蓝色葡聚糖-2000检查层析行为，在层析柱内加1mL(2mg/mL)蓝色葡聚糖-2000，然后洗脱，流速为0.5mL/min，若色带狭窄并均匀下降，说明装柱良好，然后再用2倍床体积的洗脱剂平衡。
4.加样与洗脱
将柱中多余的液体放出，使液面刚好过凝胶，关闭出口，将1mL 样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，用少量洗脱剂洗柱内壁2次，加洗脱剂至液层4cm 左右，按上恒流泵，调好流速，开始洗脱。
上样的体积，分析用量一般为床体积的1～2%，制备用量一般为20～30%。
5收集与测定
用部分收集器收集洗脱剂，每管4mL，紫外检测仪280nm 处检测，用记录仪或将检测信号输入色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。
6.凝胶柱的处理
一般凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱(2～3倍床体积)即可，若凝胶有颜色或比较脏，需用0.5mol/LNaCl 洗涤，再用蒸馏水洗。冬季一般放2个月无长霉情况，但在夏季如不用，要加入0.02%的
叠氮钠防腐。

化学发光免疫分析仪是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。化学发光免疫分析仪包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。