生化反应和生化分离

一、实验目的
1.熟悉薄层层析的操作步骤。
2.掌握薄层层析法分析细菌细胞壁糖的原理和方法。

二、实验原理
簿层层析是一种微量而快速的层析方法。该方法是把吸附剂或支持剂(例如硅胶或硅藻土)涂在玻璃板上成为一簿层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品中各个成分分离，最后进行定性鉴定和定量测定。因为层析是在吸附剂的薄层上进行的，所以称为薄层层析。实际上，薄层层析和柱层析、纸层析在原理上和操作上都是很相似的。柱层析是把吸附剂装在管中形成一个柱，在柱上进行分离。纸层析是用纸作为支持剂进行层析。薄层层析则是用铺于玻璃板上的吸附剂薄层进行层析。但是薄层层析兼备了柱层析和纸层析两者的优点。因为薄层层析是在敞开的薄层上操作的，所以它和纸层析一样，在确定混合的组分是否分开和显色等方面都比较方便，只要把显色剂直接喷到薄层上即可观察．而柱层析则要把层析谱从柱中推出或进行洗脱，然后分段收集洗脱液才能设法鉴定。在显色方面，纸层析不能用腐蚀性的显色剂，而薄层层析(如果用硅胶、氧化铝、硅藻土等无机物铺成薄层)却能耐受浓硫酸等试剂的作用。柱层析所需的样品量较大，不适于小量样品的分离；纸层析只适用于小量样品的分离；薄层层析则适应样品量范围大，一般为1μg～500mg，灵敏度高。薄层层析的另一突出的优点是展开的时间特别短(一般为几到几十分钟)，这样迅速而有效的分离效果是柱层析和纸层析所不可比拟的。由于薄层层析具有以上这些优点，而且操作方便，设备简单，所以薄层层析方法发展很快，应用范围广泛。
目前已知，细胞壁组成成分中氨基酸组分占有很高比例，与这些氨基酸相联系的变化组分是糖和氨基糖。通常，每个细菌的属具有一个特征性的细胞壁组成成分，在一个属中糖在相对比例上的变化，可以区分不同的种。因此细胞壁的组分之一糖的分析鉴定，在细菌分类中有着重要的意义。糖的分析已列为细菌分类的生化指标之一。特别是对棒状菌和放线菌来说，细胞壁中的糖是重要的分类指标。本实验采用了具有吸附层析原理的硅胶薄层层析．来分离鉴定细菌细胞壁中所含的糖类物质，为细菌的分类检索提供生化组成方面的依据。

三、仪器、原料和试剂
仪器
摇床、超声波发生器，功率150w、离心机、安管、5cm×15cm 玻璃板、吹风机、烘箱、酒精水平仪、喷雾器。
原料
枯草芽孢杆菌。
试剂
1. 菌体培养基
2. 0.05mol/LpH7.6磷酸盐缓冲液
3. 胰蛋白酶
4. 氢氧化钠
5. 羧甲基纤维素
6. 0.8％生理盐水
7. 2mol/L 的盐酸
8. RNA 酶
9. 硅胶H
10. 乙酸乙酯
11. 甲醇
12. 乙酸
13. 已知糖溶液：称取标准糖鼠李糖、甘露糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖各50mg，分别溶于5mL 水。
已知糖混合液：将上述糖溶液以等体积混合。
14. 苯胺—二苯胺—磷酸试剂：4g 二苯胺，4mL 苯胺及20mL85%磷酸溶于200mL 丙酮。苯胺存放时间过久，颜色变成棕黄色，需重配后使用。
15. 茴香醛—硫酸试剂：取0.5mL 茴香醛加到50mL 乙酸中，混匀，再加入1mL 浓硫酸。临用前配制。
16. 1，3—二羟基萘酚—硫酸试剂：20mg1，3—二羟基萘酚加10mL 乙醇，再加0.2mL 浓硫酸。
四、操作步骤
(一)菌体培养及样品的准备
1.菌体培养：以枯草芽孢杆菌为例。
培养基成分为：1％蛋白胨，0.5％氯化纳，1％牛肉汁，调pH 至7.2。
将培养基装入500mL 三角瓶内，每瓶100mL，灭菌，5.52×10Pa，30分钟。灭菌后的培养基冷至约30℃，用接种环取菌株一环，接种于培养基内。摇床培养，30℃/22h。
收集菌体：将细菌连同液体培养基，4500r/min，离心10分钟并用0.8％生理盐水洗涤菌体两次。
2.菌体细胞壁的提取
取3g 菌体，加20 mL 水，超声处理10 min(功率150w)。将超声处理后的悬液4000r/min，离心10分钟，弃去沉淀(其中包含完整的细胞)，收集上清液，于15000g 离心15 min，弃去上清液，将沉淀物悬浮于5mL0.05mol/L 的pH7.6磷酸盐缓冲液中，加RNA 酶，按0.5mg/mL 于37℃消化1小时。然后于25000g离心15min，弃去上清液，将沉淀物用水洗涤一次。再悬浮于5mL0.05mol/L 的pH7.6磷酸盐缓冲液中，加胰蛋白酶(trypsin)0.5g/mL，于37℃消化3h。然后离心，弃去上清液，将沉淀用水洗涤3次，即得纯净的细胞，于冰箱内保存备用。
3.细胞壁的水解
取4g 细胞壁．放入安瓶管内，加入0.4mL2moL 的盐酸，封口维持100℃，水解2小时。室温冷却，开管。用氢氧化钠和浓硫酸做干燥剂，进行真空干燥。点样前加0.1mL 水，将干燥的样品溶解，用氨水调pH 至中性。
(二)样品在硅胶H 薄层上的径向层析
1.硅胶H 薄层板的制备
取5cm×15cm 的玻璃板一块，洗净，烘干，放在水平台面上。取1g 硅胶H，放在小研钵中，加 3.4mL0.5％羧甲基纤维素(CMC)溶液(起粘合作用)．加4~5滴95％乙醇(消除泡沫)，研磨数分钟后，将研好的浆液倒在预先准备好的玻璃板上．用玻璃棒将浆液铺开，再将玻璃板拿起稍加振动，使浆液分布均匀，放在水平台面上，待水分蒸发后，置105℃烘箱中，活化30min。薄层厚度约为0.25mm。
按照右图中的图形和规格，在硅胶H 薄层上用刀片刮去图中阴影所示部位，使硅胶H 薄层上呈现一个细的颈部，此板即为径向湾层层析板。径向薄层层析的优点是，样品展层后图谱呈弧形带状，Rf 值相近的化合物也能清楚地分开。如此制作4~6块薄层板，备用。
2.点样
按照图中所示点样位置，将样品及已知糖混合液分别点在两块薄层板上。点样量约20～30μL，分次滴加．使点扩散后其直径不超过5mm。点样过程中．可用吹风机使样品干燥，也可自然干燥。

3.展层
将点好样品的薄层板置于密闭的容器或薄层层析缸中，用新配制的展开剂乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水＝12：3：3：2(体积比)，采用倾斜上行法，如图3—4，将薄层板的下端浸在展开剂中0.3～0.5cm，展开剂借毛细管作用，经过硅胶H 层的细颈部，由下而上扩展。用此种形状的薄层展开的时间较一般的薄层稍长，这是由于点样处狭窄通过溶剂少的缘故。一般至展开剂距薄层板的上端约1cm时取出。放置通风处自然干燥，或用吹风机吹干。

1.玻璃盖 2.薄层层析板 3.支撑物 4.层析缸 5.溶剂
4.显色
在除去溶剂后的薄层上，进行喷雾显色。喷雾时要求喷出的雾点细而均匀。糖的显色剂种类很多，可根据实验室的条件选择使用。下面仅介绍三种显色剂。
(1)苯胺—二苯胺—磷酸试剂：喷雾后于85℃烘烤10min，各种糖显不同颜色。
(2)茴香醛—硫酸试剂：喷雾后于100～105℃烘烤至显色，最低检出量为0.05μg，各种糖显不同颜色，此试剂对硼酸处理过的硅胶薄层显色灵敏度较差。
(3)1，3—二羟基萘酚—硫酸试剂：在110℃预热的薄层上喷雾，几分钟后在白色背景上显出不同颜色的斑点，若是喷雾后再加热，色点变深，底色也变深。

薄层：硅胶H1；显色剂：本胺—二苯胺—磷酸试剂；展开剂：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2(v/v)
5.样品中糖的定性鉴定：
薄层显色后，参考显色斑点的颜色，相对位置及Rf 值，Rf 值的定义是：从样品层析的起点(原点)到层析斑点中心的垂直距离与从原点到溶剂流动的前沿的垂直距离的比值。

将样品图谱与标准图谱相比较，确定样品中含有那几种糖，如图3—5和表3—1，并根据观察，用”十”、”十十”、”十十十”等表示各种糖的相对含量。
为得到确切的结果，应在相同条件下重复上述酶层层析实验，应得到重复性的结果。