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标题:用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用

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用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用

【基本原理】
    转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中,是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化,此酶催化氨基酸的α-氨基转移到另一α-酮基酸上。各种转氨酶的活性不同,其中肝脏的谷丙转氨酶(Glutamic  Pyruvic  Transaminase ,GPT)活性较高,它催化如下反应:                     
          α—酮戊二酸 + 丙氨酸  谷氨酸 +  丙酮酸
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物,加肝匀浆保温后,用纸层析法检查谷氨酸的出现,以证明转氨基作用。
纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物,滤纸纤维与水亲合力强,能吸收20~22 %的水。而且其中6~7 %的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合,在一般情况下很难脱去,而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱。所以纸层析是以滤纸纤维结合水作为固定相,以有机溶剂作为流动相。在用纸层析法分离氨基酸时,由于各种氨基酸在此二相中的分配系数不同,各有一定的迁移率。极性弱的氨基酸,易溶于有机溶剂即分配系数小,随流动相移动较快,Rf值大;而极性强的氨基酸相反,据此可以分离鉴定氨基酸。
本实验用圆滤纸进行水平型层析,除待测液外,点加对照液和标准液,层析后用茚三酮法显色,对此观察色斑,判定结果。
【器材】
玻璃匀浆器、离心管、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、10cm圆滤纸、吹风机、手术剪刀。
【试剂】
1.0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。
2.0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。
   3.0.1mol/L丙氨酸溶液
称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH7.4后, 加磷酸盐缓冲液至100ml。
     4. 0.1mol/Lα-酮戊二酸   
称取α-酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后,加磷酸盐缓冲液至100ml。
    5.0.1mol/L 谷氨酸溶液
称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。
6.0.5%茚三酮溶液
称取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。
7.层析溶剂
酚:水= 4:1(V/V)混匀备用。现用现配。
【基本操作】
   1.匀浆制备:取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液1.0 ml,迅速研成匀浆,用上述缓冲液3.5ml混匀备用。
   2.酶促反应过程
(1)取离心管两支,编号:1(测定管)、2(对照管),各加肝匀浆0. 5ml。把对照管放沸水浴中加热5分钟,取出冷却。
(2)各加0.1mol/L丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液1.5 ml,摇匀。
(3)37℃保温,1小时后取出。
(4)把测定管放沸水浴中煮5分钟,取出后冷却
(5)两管皆离心2000rpm 5分钟,把上清夜分别移入小试管中,标清管号,供层析用。
3.层析
把手洗净,操作中尽可能少用手接触滤纸,以免污染。
(1)取圆形滤纸一张(直径10cm)放洁白纸上,以圆点为中心,约1 cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点(见图10-1)。
(2)点样:用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处。把测定液、对照液分别点在原点1、3处。具体方法是用毛细玻璃管吸取少量液体,点到滤纸点上。注意点样点不宜过大(应在直径0.4cm以下)。如果测定液中氨基酸浓度低时,可在第一次点样点干后,再在原处同样点1~2次。
(3)层析:先在滤纸圆心处打一小孔(铅笔芯粗细),再取同样滤纸一条(约1Χ2.5cm
卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中。
(4)把层析溶剂(酚:水= 4:1溶液)数ml放入干燥的直径约5 cm的表面皿内。
把此皿放在直径10 cm的培养皿中。
(5)把滤纸平放在上述培养皿上,使纸芯下浸入酚液中,盖上培养皿盖(图-2)。
可见酚液沿纸芯上升到滤纸中心,渐向四周扩散。当酚液前缘到离滤纸边缘约1cm时(约30~50分钟),取出滤纸,用镊子小心取下纸芯,并用吹风机吹干滤纸。

4.显色
用喷雾器向上述滤纸均匀喷上0.5 %茚三酮溶液,用吹风机热风吹干,可见出现同心
弧状色斑,用铅笔圈下各色斑。比较各色斑的位置及颜色深浅,并按下列公式计算各色斑的Rf值,以此判定结果。

[注]
1.层析点样时手要洗净,操作中尽可能少量接触滤纸,以免污染。
2点样点不宜过大,直径小于0.4cm。
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happylife123[使用道具]
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感谢楼主分享,在生化分析仪中测试项目中,谷氨酸脱氢酶是一种主要存在于细胞线粒体基质中的酶,以肝脏含量最高, 其次为肾脏、胰腺、脑、小肠粘膜及心脏等器官。正常人血液中GLDH活性很低,在肝细胞发生坏死时进入血液,因此肝脏疾病时尤其是涉及肝细胞线粒体损害时其活性升高显著,故常用来检查线粒体的受损程度,是肝实质损害的敏感指标。乙醇中毒伴肝细胞坏死、慢性肝炎、卤烷致肝细胞中毒、缺血性肝炎时血清中GLDH的活性明显升高。GLDH可用于阻塞性黄疸和非阻塞性黄疸鉴别、高血清转氨酶的鉴别诊断、评价肝细胞损害的严重程度等。对于肝脏疾病的诊断,GLDH敏感性优于ALT、AST。
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