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标题:【讨论帖】 Western blot问题解答专帖

applebook=213[使用道具]
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发表于 2012-11-30 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

WESTERN电泳过后 转膜失败 求原因！
电极没反 温度4度 但就是没转出来（看不到MARKER）
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 轰轰 于 2012-11-30 09:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我ECL显色肉眼可观察到条带。我用柯达的胶片压片2分钟，显影1分钟，却没有条带。而且整张片子都是黑的。胶片是3年前买的，有问题吗。
另外，我在Western Blotting专题看到ECL直接成像的，也听说这种方法。不知如何操作，还是要 ...

胶片已经过期了
换新胶片
肉眼都能看到的条带最多压片30s
直接成像是需要真闷仪器的
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 applebook=213 于 2012-11-30 09:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

WESTERN电泳过后 转膜失败 求原因！
电极没反 温度4度 但就是没转出来（看不到MARKER）

说的具体点
电极没反，那么你的胶、膜的顺序呢？
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发表于 2012-11-30 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.在蛋白印迹中，我是做大鼠脑组织的。在提取蛋白过程中，细胞裂解液和脑组织的克数要成比例吗？细胞裂解液液的配方是什么？我都见到好多版本！斑竹能否给个权威些的？还有各种蛋白酶抑制剂，像PMSF、EDTA、胰蛋白酶抑制剂等必须都要加吗？它们应该配多大浓度？
2.我用湿法转膜，所有的wattm滤纸，只要滤纸不破都可以长期使用吗？半干转就必须每做一次都要使用新的吗？
3.细胞裂解液提取蛋白后，有人说必须马上变性吗？但有人说也可以不变性，-70°冰箱能长期放，是吗？
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发表于 2012-11-30 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨天做的WB,出现了跟前面一样的情况,肉眼观察到荧光,但是自动洗片后上面什么都没有,一片空白.胶片今年11才过期。不知道能否指点一下?
我们压片20min.
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ha111[使用道具]
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发表于 2012-11-30 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我是提取 水稻叶片中的蛋白，是用bradford方法定量的，但是用考马斯亮蓝染色后，条带不是很一致，老师说定量看Rubisco条带是否一致即可，但我想问的是，需要内参吗，比如actin抗体，这样是否更加能说明问题？
3个问题：1怎么样更好的定量
               2是否需要内参，什么内参
               3杂交是在常温下进行的吗
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ha111[使用道具]
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发表于 2012-11-30 09:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有个问题，我的抗体放在-20度的冰箱1年了，还可以继续用吗，会不会降解了？
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-11-30 09:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好！我这段时间做western blot，按照“两张滤纸-NC膜-凝胶-两张滤纸”的顺序叠好三明治，然后胶向着负极，膜向着正极，100mA，2h，凝胶考染后，没有蛋白带，而NC经丽春红染色后，膜上没有蛋白带，这是怎么回事呀？另外我做过转膜时间梯度对比，100mA转膜40分钟，凝胶上marker残留部分，目的蛋白大部分都残留在凝胶里；转80分后，凝胶里残留一大分子量的marker条带，目的蛋白只有极少量残留。而NC膜经丽春红染色后，依然没有显示蛋白带。

我的电转移缓冲液是按照卢圣栋的《现代分子生物学实验技术》第二版上的方法配制 ，没有加甲醇。

请高手指教，谢谢！
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 09:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 IAM007 于 2012-11-30 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1.在蛋白印迹中，我是做大鼠脑组织的。在提取蛋白过程中，细胞裂解液和脑组织的克数要成比例吗？细胞裂解液液的配方是什么？我都见到好多版本！斑竹能否给个权威些的？还有各种蛋白酶抑制剂，像PMSF、EDTA、胰蛋白酶抑制剂等必须都 ...

1，我不知道你的目的蛋白是什么，怎么建议你配方？
2，一般选择组织重量：裂解液=1：9或者1：10，也就是1g组织加入9ml或者10ml裂解液
3，湿转滤纸我不建议重复使用，会有蛋白在上面
4，在-70度保存几个月没问题
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 09:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 bring 于 2012-11-30 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

昨天做的WB,出现了跟前面一样的情况,肉眼观察到荧光,但是自动洗片后上面什么都没有,一片空白.胶片今年11才过期。不知道能否指点一下?
我们压片20min. ...


这位群友，估计您胶片提前曝光了
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