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标题:【讨论帖】 Western blot问题解答专帖

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发表于 2012-11-30 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的实验中需要找出处理组和对照组的差异蛋白，用什么方法比较好？谢谢LZ。
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发表于 2012-11-30 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：我的目的蛋白只有8kD,表达量少，不知道该怎么办？
我现在用Tricine-sds,16%
阳性对照也要压片一个小时才看的不是很清楚，用甘氨酸-sds就很容易
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发表于 2012-11-30 10:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是硝酸纤维素膜，蛋白marker凝胶染色后，条带是清晰的，但转膜后染色，最多就只能看到一根条带。有时什么条带都看不到。有时候目的蛋白能看到一两根较浓的带，现在不知道是marker的问题还是丽春红抑或者是膜的 ...

_______________________________

第一：重新配置丽春红染色液
第二：检查转膜条件
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 10:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做western最近老是条带弥散或很淡 抗体一年多了 会不会是抗体过期了？另外那位做过免疫共沉淀电泳？谢谢！

————————————————————————————————

一年左右抗体如果没有反复冻融、保存条件得当是没有大问题的
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发表于 2012-11-30 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近在做western   blot一直不顺利，从大鼠脑组织提取的蛋白，提取后即变性，-20度保存，最近的才半个月，上样量已经65微克，内参表达很强，可是三个目标蛋白一直没有条带，一抗全是进口的，有santa cruz的，abcam的 ...

——————————————

你的目的蛋白是什么啊
可能没有提取出来
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wsll 于 2012-11-30 10:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的实验中需要找出处理组和对照组的差异蛋白，用什么方法比较好？谢谢LZ。

比较单个蛋白的表达差异还是整个蛋白组的差异啊
如果是某些特定的蛋白可以用Western
多的话可以用蛋白组学检测了
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发表于 2012-11-30 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 remenb 于 2012-11-30 10:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问：我的目的蛋白只有8kD,表达量少，不知道该怎么办？
我现在用Tricine-sds,16%
阳性对照也要压片一个小时才看的不是很清楚，用甘氨酸-sds就很容易

什么意思？
如果glycine-SDS很容易那你就用这个系统啊
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发表于 2012-11-30 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近要测一批样品的脯氨酸含量及生物总碱的含量，样品量不超过3克。我想问一下测定这两种含量时，都需要提取。脯氨酸用5ml3%的磺基水杨酸沸水浴中加热10min，过滤，取滤液2ml然后显色测定。我想问之前样品需要烘干研碎吗？烘干的条件？我用茶叶试验了一下，想滤出2ml溶液有点困难，请问有没有好的过滤方法？还有就是生物碱的测定方法，我目前还没找到一个标准。急需！！谢谢指导！
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发表于 2012-11-30 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问下楼主，western blotting 用HRP标记的抗体，DAB直接显色法和常规ECL法能够检测到得蛋白灵敏度是多少啊，我如果用DAB直接显色能够检测到几个ng的目标蛋白吗？

多谢
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2012-11-30 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

洗完X光片后，发现条带和SDS-PAGE上的条带居然一样，没有出现特异性条带.连MARKer带都有。
请问PBS的pH是不是很重要，可能PH计不准确，导致PBS的PH不准，洗脱液没有把游离的一抗给洗掉，最终导致X光片是所有蛋白的印迹。
对于这种情况，请专家给我一些建议，谢谢
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