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标题:【讨论帖】 Western blot问题解答专帖

wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 DNA 于 2012-11-30 10:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问下楼主，western blotting 用HRP标记的抗体，DAB直接显色法和常规ECL法能够检测到得蛋白灵敏度是多少啊，我如果用DAB直接显色能够检测到几个ng的目标蛋白吗？

多谢 ...

具体多少ng我不清楚
ECL与DAB敏感性至少相差百倍
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 XYZQ 于 2012-11-30 10:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

洗完X光片后，发现条带和SDS-PAGE上的条带居然一样，没有出现特异性条带.连MARKer带都有。
请问PBS的pH是不是很重要，可能PH计不准确，导致PBS的PH不准，洗脱液没有把游离的一抗给洗掉，最终导致X光片是所有蛋白的印迹。
对于这 ...

pH很重要
抗体孵育的时候要有个稳定的pH环境
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发表于 2012-11-30 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主 我做WESTERN BLOTING 时 用ecl发光试剂 胶片曝光显影，但是滴加ecl发光试剂时，整个pvdf膜都放光，最后胶片都是黑的，也见不到目的条带！请问是何原因？如何解决？谢谢
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发表于 2012-11-30 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的蛋白在原核里表达的是单体，但是不知道在真核里是什么样的。据文献知道与它同源的蛋白在其他生物里都是多聚体，如何通过WB证明我的蛋白在真核里是几聚体。
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S6044[使用道具]
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发表于 2012-11-30 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我现在做蛋白纯化，跑PAGE电泳时，8%，10%以及12%的分离胶都只能得到一条带，而正常情况下应该都有两条，请问这是什么原因
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发表于 2012-11-30 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 u234 于 2012-11-30 10:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主 我做WESTERN BLOTING 时 用ecl发光试剂 胶片曝光显影，但是滴加ecl发光试剂时，整个pvdf膜都放光，最后胶片都是黑的，也见不到目的条带！请问是何原因？如何解决？谢谢 ...

抗体有问题
另外增加洗膜次数
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 dragonkilly 于 2012-11-30 10:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的蛋白在原核里表达的是单体，但是不知道在真核里是什么样的。据文献知道与它同源的蛋白在其他生物里都是多聚体，如何通过WB证明我的蛋白在真核里是几聚体。
...

没做过这个
你查查文献
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 S6044 于 2012-11-30 10:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我现在做蛋白纯化，跑PAGE电泳时，8%，10%以及12%的分离胶都只能得到一条带，而正常情况下应该都有两条，请问这是什么原因

样品缓冲液用的是还原的还是非还原的？
非还原的打不开二硫键
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发表于 2012-11-30 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：提取大鼠脑组织中的膜蛋白，如何能保证提取比较完全？同时还要提取酶？两种蛋白可以同时提取吗？等待回复！谢谢！
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 gogo 于 2012-11-30 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问：提取大鼠脑组织中的膜蛋白，如何能保证提取比较完全？同时还要提取酶？两种蛋白可以同时提取吗？等待回复！谢谢！

膜蛋白的提取有专门的膜提取试剂盒或者采用RIPA强配方（如果目的蛋白丰度大的话）
你说的这种酶我就不清楚了
在细胞的那个位置？
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