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标题:【讨论帖】 Western blot问题解答专帖

mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
WESTERN时,我不小心把蛋白MAKER加样电泳了,转膜后加一抗二抗显影后,居然在蛋白MAKER的那个条带,发现一条介于30~40KD的粗条带,请问是怎么回事,蛋白MAKER也可以加一抗二抗显影出来嘛?
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mickeylin 于 2012-11-30 11:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
WESTERN时,我不小心把蛋白MAKER加样电泳了,转膜后加一抗二抗显影后,居然在蛋白MAKER的那个条带,发现一条介于30~40KD的粗条带,请问是怎么回事,蛋白MAKER也可以加一抗二抗显影出来嘛?
...

你用的是什么Marker？
看看Marker的背景信息
有些是可以显影的
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any333[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
显影后杂带很多，目的带几乎看不到。（转膜一个半小时，加一抗封闭过夜效果也不好）。如何改进
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请问： 连续重复2次，都是白板（什么也没有，连b-actin都没有）。

这两次实验距离第一次成功的实验只有2个星期(抗体都是-20度存放的，且同学2天前用该抗体都成功了）

条件和原来做成功的一样（包括制胶，跑胶，转膜条件，抗体浓度），一抗b-acrin 是1：20000，二抗是1：5000。

蛋白也是第一次做成功提取的蛋白，但是这次连band都没有。（上次有band的）

不知道为什么连续2次什么都没有？

谢谢高手解答！不知道是哪个环节出错了？
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 any333 于 2012-11-30 11:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
显影后杂带很多，目的带几乎看不到。（转膜一个半小时，加一抗封闭过夜效果也不好）。如何改进

把一抗浓度稀释一倍、两倍做预实验
上样量也可减小试试
如果还是不行就要考虑一抗的问题了
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 fsdd817 于 2012-11-30 11:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想请问： 连续重复2次，都是白板（什么也没有，连b-actin都没有）。

这两次实验距离第一次成功的实验只有2个星期(抗体都是-20度存放的，且同学2天前用该抗体都成功了）

条件和原来做成功的一样（包括制胶，跑胶，转膜条件，抗体浓度），一 ...

操作上有没有问题啊？
另外你的样品冻融有几次？
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发表于 2012-11-30 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的阳性蛋白只冻融过一次，而且我的蛋白量是100ug。而待测蛋白是刚提的

会不会是所提的蛋白有问题呢？

谢谢！
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发表于 2012-11-30 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好:
     我刚开始做western blot，结果用Quantity One凝胶分析软件拍的图像很暗，最后用数码相机拍照，请问怎么分析它的IOD值。谢谢！


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2012-11-30 11:07
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发表于 2012-11-30 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 xue258 于 2012-11-30 11:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的阳性蛋白只冻融过一次，而且我的蛋白量是100ug。而待测蛋白是刚提的

会不会是所提的蛋白有问题呢？

谢谢！

一般10g左右beta-actin，beta-tubulin，GAPDH这三种常用内参都能检测到很强的信号
蛋白提取有没有问题咨询一下你身边的人
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 101010 于 2012-11-30 11:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好:
     我刚开始做western blot，结果用Quantity One凝胶分析软件拍的图像很暗，最后用数码相机拍照，请问怎么分析它的IOD值。谢谢！

我以前用ImageQuant TL这个软件来读取IOD值
但是这个软件试用期只有14天
Quantity One好像要把图片变成白色背景，黑色条带才能读的
具体的你看看软件的使用吧
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