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标题:【讨论帖】 Western blot问题解答专帖

bamboo16[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

NMDA-NR2A和NMDA-NR2B的分子量各是多少，能不能在一张膜上同时检测这两种蛋白？加两种抗体
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bamboo16 于 2012-11-30 11:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

NMDA-NR2A和NMDA-NR2B的分子量各是多少，能不能在一张膜上同时检测这两种蛋白？加两种抗体

分子量多少上网查 啊
不能同时加两种抗体（如果两种一抗都是小鼠来源的单抗可以考虑）
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发表于 2012-11-30 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胶片显影是白片，连actin也没有任何条带，但丽春红染色可以看到蛋白质条带，前一天实验用同样的一抗和二抗可以看到条带。这次试验和前一次不同的是换了一瓶自己配的TBST，重复了一次还是白片。不知道这是什么缘故
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主：做western的酶的提取方法和测这种酶活性时的提取方法是一样的吗？提取做WESTERN的酶的方法有什么特别之处吗？
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 jkobn 于 2012-11-30 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

胶片显影是白片，连actin也没有任何条带，但丽春红染色可以看到蛋白质条带，前一天实验用同样的一抗和二抗可以看到条带。这次试验和前一次不同的是换了一瓶自己配的TBST，重复了一次还是白片。不知道这是什么缘故
...

检测TBST的pH值
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 qianqin1977 于 2012-11-30 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问楼主：做western的酶的提取方法和测这种酶活性时的提取方法是一样的吗？提取做WESTERN的酶的方法有什么特别之处吗？

测定酶的活性要求提取的时候蛋白不能变性
而WB提取蛋白的裂解液一般都会使蛋白变性，需要注意裂解液中的离子强度（有些WB的提取buffer能使提取出来的蛋白有活性）
欢迎继续交流
good luck
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

了解了。另外如果文献上没有查到这种蛋白做WB的相应方法，应该怎么办？我的意思是这时候该用什么样的
裂液解液呢？
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发表于 2012-11-30 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
了解了。另外如果文献上没有查到这种蛋白做WB的相应方法，应该怎么办？我的意思是这时候该用什么样的
裂液解液呢？

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查蛋白的在细胞中的定位
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在做转膜的时侯用的Marker有六条带（14.4-97KD）,转移条件是湿转、恒压80v、2.5h。我用的电转仪是六一的40B型，电极间距离有8cm。转膜结束后Marker有间隔的三条带转到了膜上（不知道什么原因），丽春红染色液显示有目的条带。结果在做完免疫检测（HRP法，参考汪家政的《蛋白质技术手册》）后却没有条带，而且Marker的三条带也被洗掉了。

看到许多战友在帖子中提到转膜时要压紧，不知道应该进到什么程度？

另外我们如何确定转膜过程是否短路呢?看到有的战友提到在半干转时,可以让膜>= 滤纸> 胶在湿转时是否可行呢?

目的蛋白的上样量下限为多大呢？

请大侠帮忙分析一下，不吝赐教。
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-11-30 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1，把胶、膜、滤纸弄好后可以用玻璃棒压紧即可，过分压紧会使胶破碎
2，湿转没有短路现象
3，目的蛋白上样量下限要看目的蛋白的丰度
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